李建軍，吳美慧，葉惠欣，黃 韌

(廣東省實驗動物監(jiān)測所，廣東省實驗動物重點實驗室，廣州 510663)

我國現(xiàn)行的魚類毒性試驗標準中，大多僅規(guī)定了 試驗魚體長或體重范圍，而未對其發(fā)育期提出要求［1－4］。硬骨魚類胚后發(fā)育可分為仔魚、稚魚、幼魚、成魚4個主要時期，受環(huán)境、營養(yǎng)等因素的影響，相同體長或體重魚類可能處于不同的生長期，而不同生長期魚類對毒物的敏感性存在較大差異，如褐牙鲆仔魚階段對勝利原油的敏感性遠遠大于稚魚階段［5］。

諸氏鯔蝦虎魚(Mugilogobius chulae)屬于鱸形目，蝦虎魚科，鯔蝦虎魚屬，為暖水性底層小型魚類，分布于香港、日本、菲律賓、泰國及西太平洋海域，棲息于河口、咸淡水水域中，體長(30～40)mm［6］，具有分布廣、個體小、性成熟早、生殖力強、產(chǎn)卵間隔期短等特點。目前筆者已完成該魚的全人工繁育技術研發(fā)，初步應用試驗結(jié)果表明，該魚對污染物敏感、實驗操作方便、結(jié)果重復性強，是毒性試驗中優(yōu)良的受試生物。

鉆井液指在鉆井過程中使用的具有潤滑和冷卻鉆頭、攜帶鉆屑、平衡地層壓力等作用的循環(huán)流體，包括水基鉆井液、油基鉆井液和合成基鉆井液。鉆井液是提高鉆井效率的重要手段，在石油與天然氣的開采、鉆探以及修井過程中，都會產(chǎn)生大量的鉆井液，其主要污染物包括 (1)石油類，為改善鉆井液的潤滑性能而人為添加的油基潤滑劑和鉆進油層時進入到鉆井液中的原油;(2)重金屬，如Hg、Cd、Ti、Pb、Cr、In、Sn 等;(3)有機物，如丙烯酞胺、丙烯晴等;(4)鉆井液添加劑，如造漿材料、加重材料、降濾失劑、增粘劑、乳化劑、頁巖抑制劑、降粘劑、絮凝劑、潤滑劑、殺菌劑、消泡劑、解卡劑、緩蝕劑、堵漏劑及泡沫流體、飽和鹽水鉆并液等;(5)無機鹽類。目前，國內(nèi)外對廢鉆井液的環(huán)境影響和毒性評價工作都非常重視，只有通過對各種體系、類型的鉆井液對動植物生長、發(fā)育、殘毒和毒性等一系列指標的測試研究，才能確切地了解其對生態(tài)環(huán)境影響的程度［7］。

本文以諸氏鯔蝦虎魚為實驗魚類、以鉆井液為參比毒性物質(zhì)，比較了其早期仔魚、中期仔魚、晚期仔魚、稚魚、幼魚及成魚對毒性物質(zhì)的敏感性，為篩選試驗魚適宜急性毒性試驗的發(fā)育期，進一步修訂相關毒性試驗標準積累基礎數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 受試物

水基鉆井液:中海石油(中國)有限公司某分公司鉆井部提供，棕褐色液體，陰涼處保存，參照文獻［8］方法，配制為 31.25、62.5、125、250、500 mg/L五個濃度梯度。

1.2 試驗條件

早期仔魚(2日齡)、中期仔魚(10日齡)、晚期仔魚(20日齡)、試驗容器為250 mL玻璃燒杯，試驗溶液為100 mL，稚魚(30日齡)、幼魚(54～56日齡)、成魚(150日齡)試驗容器分別為500 mL、1 000 mL、2 000 mL玻璃燒杯，試驗溶液分別為 400、800、1 500 mL;鹵蟲試驗容器為100 mL玻璃燒杯，試驗溶液為50 mL;每試驗容器放生物10個，各試驗組設2個重復;試驗用海水經(jīng)沙濾和紫外滅菌處理，pH 值 8.1 ～8.3，鹽度 29，溶氧 5.0 ～7.2 mg/L。試驗期間水溫為(24～26)℃，自然光照。試驗期間早期仔魚不投餌，中、晚期仔魚毎尾每24 h投喂約500個輪蟲，稚、幼、成魚毎尾每24 h投喂約10～20個鹵蟲無節(jié)幼體，毎個鹵蟲每24 h投喂鹽藻適量。

1.3 結(jié)果判定與統(tǒng)計

仔、稚、幼魚以輕觸無反應或在體視顯微鏡下觀測心臟停止跳動判定為死亡;鹵蟲沉到容器底部15 s內(nèi)不能游動者判定為死亡。

半致死濃度(LC50)及95%置信區(qū)間的計算采用概率單位法或 Spearman－Karber計算法［8］

2 結(jié)果

2.1 鉆井液對不同發(fā)育期諸氏鯔蝦虎魚的急性毒性

鉆井液對不同發(fā)育期諸氏鯔蝦虎魚的急性毒性試驗結(jié)果見表1。早期仔魚48 h半致死濃度為157 mg/L，95%置信限為130～189 mg/L;中期仔魚在鉆井液濃度為125、250、500 mg/L的試驗組中48 h死亡率分別為40、45和35%，由于對照組有2尾魚死亡，采用公式)(其中表示校正后第i組的死亡率;第i組的死亡率;表示對照組的死亡率)進行校正，則中期仔魚在鉆井液濃度為125、250、500 mg/L的試驗組中48 h校正后死亡率分別為 33.3、38.9 和 27.8%，均未超過50%，表明中期仔魚48 h半致死濃度超過500 mg/L;中期仔魚96 h半致死濃度為79 mg/L，95%置信限為50～124 mg/L;晚期仔魚96 h半致死濃度為625 mg/L，95%置信限為396～985 mg/L;96 h稚魚、幼魚和成魚死亡率低，其半致死濃度顯著大于500 mg/L。不同反應期諸氏鯔蝦虎魚對鉆井液的敏感性順序為:早期仔魚﹥中期仔魚﹥晚期仔魚﹥稚、幼、成魚。

表1 暴露于不同濃度鉆井液后各發(fā)育期諸氏鯔蝦虎魚的存活數(shù)Tab.1 The number of M.chulae at different developmental stages surviving in the drilling fluid at different concentrations

表2 暴露于不同濃度鉆井液96h后鹵蟲無節(jié)幼體的存活數(shù)Tab.2 The number of Artemia nauplius surviving after 96 hours in the drilling fluid at different concentrations

2.2 鉆井液對鹵蟲無節(jié)幼體的96h急性毒性

本鉆井液對鹵蟲無節(jié)幼體的急性毒性結(jié)果見表2，鹵蟲無節(jié)幼體96 h半致死濃度為105 mg/L，95%置信限為62～177 mg/L。

3 討論

3.1 諸氏鯔蝦虎魚在海洋污染物生物毒性評價方面具有良好的應用前景

魚類作為水域生態(tài)系統(tǒng)中較高級的消費者，環(huán)境理化因子的變化通過上行效應改變魚類群落結(jié)構和數(shù)量，而魚類群落結(jié)構的變化通過營養(yǎng)級聯(lián)和下行效應對水體的理化特征以及其它生物的組成、分布、豐度、生物量等水生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構與功能的許多方面產(chǎn)生影響，在水生態(tài)系統(tǒng)中占有重要地位;當水體受污染后，魚類能通過呼吸、皮膚吸收、體表吸附尤其是攝食等多種途徑攝取水環(huán)境中的污染物，對污染物的富集能力較強;作為低等脊椎動物的代表，魚類終生生活于水中，且有材料易得、繁殖力強、大部分體外受精、體外發(fā)育等特點，因此，相對于其它水生生物，魚類毒性試驗的應用更為普遍。

鹵蟲無節(jié)幼體也是一種常用的海洋污染物生物毒性評價的實驗生物，美國國家環(huán)保局(EPA)把它列為排污的毒性試驗生物［9］，國內(nèi)也有應用鹵蟲監(jiān)測農(nóng)藥、廢水等毒性的報道［10，11］。本研究中，諸氏鯔蝦虎魚早期、中期仔魚對鉆井液的敏感性強于鹵蟲無節(jié)幼體。此外，鹵蟲無節(jié)幼體因蟲卵來源、保存、孵化條件等不同，活力和對毒物的敏感性會出現(xiàn)一定程度差異;鹵蟲幼體和蒙古裸腹溞因附肢剛毛易粘附油性成份、干擾正常生理狀況而不適用于油基鉆井液等油性物質(zhì)的毒性評價;對蝦、貝類幼體等也因季節(jié)性因素不便于隨時開展試驗;相對于 GB/T 18420.2－2009《海洋石油勘探開發(fā)污染物生物毒性 第二部分 檢驗方法》推薦的裸項櫛蝦虎魚［8，12］，諸氏鯔蝦虎魚具有個體較小、性格溫順、廣溫、廣鹽、飼養(yǎng)管理簡便、繁殖期長，生殖力更強等優(yōu)勢，因此，敏感性適中、室內(nèi)全年可人工繁育、易于推廣應用的諸氏鯔蝦虎魚更適用于海洋污染物的毒性評價。

3.2 諸氏鯔蝦虎魚早期仔魚具有顯著的海洋污染物急性毒性評價優(yōu)勢

本研究結(jié)果表明，相對于其它發(fā)育階段，諸氏鯔蝦虎魚早期仔魚對鉆井液的毒性最敏感。魚類早期階段是整個生命周期中最脆弱的時期，早期發(fā)育是一個在形態(tài)、生理、行為等方面不斷變化的過程，對外界不良條件的刺激表現(xiàn)最為敏感［13，14］，隨著魚齡的增加，魚類對毒物的耐受度提高［15］;Mckim(1977)研究了不同學者用34種毒物和4種魚進行56次生活周期毒性試驗資料后也認為，胚胎－仔魚和早期幼魚生活階段在生活周期實驗中是最敏感的階段之一，生活環(huán)境的細微變化，就可引起胚胎和仔魚生理上的劇烈反應，由胚胎、仔魚或早期幼魚試驗估計的最大允許毒物濃度與通過更多發(fā)育階段或全生活周期的毒性試驗所獲得的結(jié)果一致［16］。

諸氏鯔蝦虎魚初孵仔魚至孵出后4日齡為早期仔魚時期，處于內(nèi)源性營養(yǎng)期，其生長發(fā)育主要消耗內(nèi)源性卵黃營養(yǎng)，此時期不需投喂餌料，成活率較高，而進入外源性營養(yǎng)期后，除對毒物的敏感性降低外，部分魚由于無法獲取足量適口食物，死亡率升高;早期仔魚階段個體小，相比于稚、幼和成魚，在試液體積、操作方便性及生產(chǎn)管理成本上優(yōu)勢明顯。因此，諸氏鯔蝦虎魚的早期仔魚更適于海洋污染物的急性毒性評價。

3.3 諸氏鯔蝦虎魚早期仔魚急性毒性試驗的時點選擇

水溫(24～25)℃，諸氏鯔蝦虎魚孵出后1～2日齡開始攝食，如不及時投喂餌料，4日齡卵黃囊內(nèi)卵黃消耗完全，此后仔魚雖可繼續(xù)存活一段時間(約24 h～48 h)，但已喪失攝食能力。為避免仔魚饑餓死亡導致的試驗誤差，建議急性毒性試驗于仔魚孵出后12 h～24 h時開始，經(jīng)24 h或48 h結(jié)束。

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［2］謝鳳君，陳惠志，趙幼一.GB/T 13267－1991水質(zhì) 物質(zhì)對淡水魚(斑馬魚)急性毒性測定［S］.

［3］于相毅，毛巖，盧玲，等.GB/T 21800－2008 化學品 生物富集流水式魚類試驗［S］.

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