匡德宣,孫曉梅 ,江勤芳,仝品芬,陸彩霞,高家紅,代解杰
(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所,云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點實驗室,昆明 650118)
樹鼩 (tree shrew,Tupaia belangeri),又稱北方樹鼩(northern tree shrew),是外形酷似松鼠的小型哺乳動物,動物學(xué)分類地位屬于介于食蟲目與靈長目之間攀鼩目 (Scandentia)[1]。
由于樹鼩特殊的分類地位和存在許多自發(fā)性疾病,體形小,易于飼養(yǎng),成本低廉,來源廣泛及新陳代謝、生理機能、大體解剖和基因組與人類具有相似性等特點,已被應(yīng)用于生殖生物學(xué)、社會心理學(xué)、免疫學(xué)、癲癇病、腦血管疾病、糖尿病等方面研究的實驗材料,被認為是一種在醫(yī)學(xué)和生物學(xué)研究方面具有廣泛開發(fā)應(yīng)用前景的動物資源[2,3],可能成為替代靈長類動物的值得選擇的小型實驗動物。為了保證樹鼩動物福利的規(guī)范化和科學(xué)化,提高樹鼩繁殖率和成活率,本文從獸醫(yī)公共衛(wèi)生及實驗動物科學(xué)的角度,對野生樹鼩的捕捉、運輸、檢疫、馴化、飼養(yǎng)、繁育及質(zhì)量控制等方面的原則及基本技術(shù)知識作一簡述,為從事樹鼩工作的有關(guān)人員及樹鼩實驗動物化研究提供參考。
野外捕捉的樹鼩數(shù)量必須嚴格控制,不應(yīng)高于科學(xué)研究需要的最低數(shù)量。野生動物引種工作人員負責(zé)野生樹鼩引種、馴養(yǎng)繁殖許可證的合法手續(xù)辦理、組織抓捕、運輸?shù)裙ぷ?。野生樹鼩的引進采購應(yīng)通過合法、正規(guī)的渠道,同時要保證樹鼩的質(zhì)量,從野外直接捕捉樹鼩,必須具有當(dāng)?shù)亓謽I(yè)部門開具的“野生動物特許獵捕證”方能捕捉[4,5]。采用的捕捉方法不能使被捕樹鼩的身體嚴重傷害或發(fā)生應(yīng)激反應(yīng),具體方法采用在小型設(shè)置彈簧法條的鼠籠具內(nèi)放置引誘食物捕捉,有可能積水或直接日曬的地點,不宜作為捕捉點。每天需到捕捉點查看數(shù)次,落網(wǎng)者應(yīng)盡快移送到集中關(guān)養(yǎng)處或檢疫設(shè)施內(nèi)。
運輸要保證樹鼩不被污染,并保持正常狀態(tài),樹鼩運輸籠具表面用消毒藥,如0.5% ~1%的過氧乙酸、1% ~2%的消毒靈、75%酒精或2% ~3%的碘伏等噴霧消毒。操作運輸籠時務(wù)必小心,操作運輸箱時最好帶上皮質(zhì)和橡膠手套、特制外衣及橡皮鞋靴?;\具的大小應(yīng)保證樹鼩有正?;顒拥目臻g,根據(jù)樹鼩喜暗怕光的特點,需要在籠具內(nèi)放置一些棉布,便于樹鼩在籠具內(nèi)躲藏,避免造成過度驚嚇;減少由于溫度變化而引起動物不適或死亡,過冷或雨天均不適宜運輸,過熱時要進行必要的通風(fēng)降溫。樹鼩運輸?shù)斤曫B(yǎng)隔離區(qū)后,打開隔離區(qū)(大籠)的外門,將樹鼩運輸籠具放入大籠內(nèi),再用消毒液噴霧后,打開運輸籠具的門,輕輕將樹鼩拿出,避免樹鼩逃逸,同時放入飼料與潔凈飲水,按照動物運輸箱上的標(biāo)簽,核對動物的出生日、性別、數(shù)量、供應(yīng)單位或來源地,記錄必要的背景資料,檢查實際情況與標(biāo)簽是否相符。運輸籠具內(nèi)的臟物,如糞便、尿、剩食物要收集,放入不漏水且可燒毀的袋內(nèi)焚化,被污染的地面需用消毒液噴霧消毒。
1.3.1 檢疫設(shè)施及籠器具:新捕捉的樹鼩運輸?shù)綄iT的檢疫室籠具內(nèi)集中管養(yǎng),檢疫室和其它樹鼩飼養(yǎng)室分隔開,應(yīng)經(jīng)常保持清潔衛(wèi)生,室內(nèi)應(yīng)有防滲透的地面及適用的地漏,以便清洗消毒,檢疫室內(nèi)應(yīng)無野鼠、鳥、蚊子及其它昆蟲。檢疫期間,每只樹鼩應(yīng)關(guān)養(yǎng)在單獨籠具內(nèi),并可清洗消毒,籠具應(yīng)有足夠空間并以適宜金屬材料制成。不同品種的或捕自不同地區(qū)的樹鼩,不可混合關(guān)養(yǎng),也不可混合關(guān)養(yǎng)在同一室內(nèi)。動物室、籠具及飼喂用具每天清洗一次,必須定期清洗消毒。經(jīng)2~4周觀察檢疫后,未被發(fā)現(xiàn)可疑現(xiàn)象時方可進入飼養(yǎng)室。動物移出時,對房間要做徹底的清洗消毒。
1.3.2 檢疫內(nèi)容:檢疫內(nèi)容包括一般性健康情況檢查和實驗室檢測。一般性健康情況檢查主要是觀察樹鼩皮毛有無光澤、豎毛、脫毛、出血、污物等;眼有無眼屎、流淚、白內(nèi)障、角膜損傷等;口腔有無流涎、出血等;耳有無外傷、耳殼曲折等;四肢有無外傷、彎曲、脫臼、腫脹、關(guān)節(jié)炎等;肛門有無腹瀉、血便、脫肛等;精神(沉默、倦怠、動作不活潑)、食欲(食欲不振、拒食)及營養(yǎng)狀況(消瘦、過度肥胖、成長異常)等。是否有姿勢異常、行走和站立困難、運動失調(diào)、跛行等狀態(tài)。實驗室檢測包括細菌、病毒、寄生蟲等,具體檢測樹鼩支原體、腸道細菌、真菌、肝炎病毒、輪狀病毒、單純皰疹病毒及體內(nèi)外寄生蟲(螨蟲、原蟲、弓形蟲)等。
1.3.3 檢疫期的馴化飼養(yǎng)管理:在自然條件下生活的野生樹鼩移到人工條件下飼養(yǎng)時,不宜立即改變原來的條件,宜采用群居的方式并模擬野外的生存環(huán)境,同時提供適合的飼料,逐漸地改變,以便動物適應(yīng)新的環(huán)境[6]。樹鼩每天最少供飼一次足夠適宜的當(dāng)?shù)厥澄?,含有適量平衡的各種營養(yǎng)成分,尤其是維生素C及蛋白質(zhì)。飲水應(yīng)經(jīng)常不斷地供給。檢疫期內(nèi)由合格人員(如獸醫(yī))每天最少一次巡視動物健康狀況。巡視內(nèi)容包括活動、食欲、下痢、流血、紅斑疹等。有臨床癥狀的動物應(yīng)立即給予隔離診斷治療。治療無效死亡的動物(應(yīng)盡可能做良好的檢查),并應(yīng)盡快移離籠具,并按合乎公共衛(wèi)生準則的方法焚化。此籠具也應(yīng)立即徹底清洗消毒。檢疫期間的記錄必須準確詳細,包括收到及出口動物數(shù)量、編號、性別、來源、用途、檢疫期每批動物的死亡率、發(fā)病率、治療程序、臨床癥狀及診斷測試等。
樹鼩飼養(yǎng)管理相關(guān)工作人員負責(zé)樹鼩的馴化、飼養(yǎng)繁殖、疾病預(yù)防、質(zhì)量控制和管理等工作,工作中最重要的注意事項是防備對人有傳染性并有生物危害性質(zhì)的樹鼩病原菌,人員必須嚴格遵守生物安全措施通則。樹鼩種群及實驗室有關(guān)工作人員上任前及任職后的血清必須定期抽樣儲存在-80℃冰箱,當(dāng)工作人員可能接觸到或感染上樹鼩病原菌時,這些血清可作為測定體內(nèi)抗體變化的對照,所有操作樹鼩或其組織的人員,最好對破傷風(fēng)、狂犬病、腦脊髓炎及乙型肝炎實行免疫。
進入樹鼩關(guān)養(yǎng)區(qū)的人員必須穿戴清潔的保護衣裝。如橡膠鞋靴、手術(shù)用手套、面罩、頭帽、防毒面具、護目鏡及全副外裝等。在實驗室捕捉或固定接觸樹鼩時務(wù)必小心,必須穿戴這些保護用衣罩,如不慎被樹鼩咬傷、抓傷或被樹鼩籠劃傷時,應(yīng)當(dāng)場立刻以肥皂水、清水及75%的酒精沖洗消毒,然后再采取其他醫(yī)療措施醫(yī)護。由于手套較易傳染動物之間的病原菌,因此,每間動物室需用專用手套,不能在不同動物室間混用。除手套外,當(dāng)進入其它樹鼩飼養(yǎng)室時,其它保護衣罩都要換下,所有保護及罩用完后必須徹底清洗消毒。在動物室及實驗室內(nèi)嚴禁吸煙、飲水及吃食物。使用樹鼩的單位應(yīng)對工作人員進行健康及安全的具體培訓(xùn)。
使用單位購入樹鼩時,實驗人員應(yīng)向相應(yīng)部門索取所用動物相應(yīng)的《國家重點保護野生動物馴養(yǎng)繁殖許可證》復(fù)印件,動物的遺傳背景資料、動物微生物檢查資料及動物年齡和健康方面的資料,必要時要求對方提供方便運輸?shù)挠嘘P(guān)證明材料[7]。樹鼩和對之間可能潛在相互傳染的病原菌,樹鼩運到后不能直接進入飼養(yǎng)區(qū),必須在檢疫區(qū)隔離1~2周,因此,實驗單位隨時隨地都要把樹鼩(即已通過檢疫)的活體及血液、淋巴唾液、排泄物等認作其對人具有潛在的危險性。操作樹鼩及其組織的人員必須遵從適當(dāng)程序來保護自己的安全,為達到保護目的,必須有獸醫(yī)及相關(guān)人員對樹鼩及實驗室的支持。
樹鼩的繁殖是其實現(xiàn)實驗動物化及各項研究不可缺少的基礎(chǔ)條件[8]。由于大部分樹鼩的生殖、生理不清楚,因此繁育水平工作需依靠科學(xué)研究來推動。只有經(jīng)過適當(dāng)檢疫期而判為健康無傳染病原的動物才可作為種群。建立樹鼩人工繁育中心不但能保障有足夠數(shù)量的樹鼩供科研使用,避免使用野生樹鼩所帶來的危害性,還能供應(yīng)高品質(zhì)、年齡、血源及遺傳性更明確的樹鼩,從而成為保護野生樹鼩的良策。擁有原生樹鼩資源的國家較易得到所需高品質(zhì)的繁育種群,因此政府當(dāng)局應(yīng)鼓勵建立樹鼩的繁育。種群的維持、管理及定期檢查是導(dǎo)致成功繁育的基本條件,要想提高樹鼩種群的繁殖力,應(yīng)特別注意以下幾方面的工作:
挑選體況好無傷病,被毛光亮,雌樹鼩乳頭大且均勻,雄樹鼩睪丸明顯。有下列情況不作為種用:體重小于110 g,體況消瘦的母樹鼩;被毛粗亂、無光澤或脫毛的樹鼩;骨盆腔狹窄的母樹鼩;陰莖斷裂或隱睪的公樹鼩。把母性好、產(chǎn)仔數(shù)多的母樹鼩作為基礎(chǔ),進行選種;一般從第2胎至第4胎中選取繁殖種用樹鼩;從一窩中選取發(fā)育較好、體格健壯,并符合品系特征的作為種用樹鼩[9]。
雄雌樹鼩按1∶5留種,采用隨機交配法,雌雄樹鼩按1∶1合籠同居交配,自合籠之日起,第20~30天進行妊娠檢查,通過腹部觸診的方法觸摸子宮內(nèi)胚胎,如摸到子宮內(nèi)有一節(jié)節(jié)的圓或長形的硬滑塊,則斷定母樹鼩已經(jīng)懷孕[10]。
確診懷孕的母樹鼩轉(zhuǎn)移到生產(chǎn)間單籠分居飼養(yǎng)待產(chǎn),轉(zhuǎn)入妊娠期管理,需保持安靜,加強營養(yǎng),以籠號為樹鼩固定編號進行生產(chǎn)記錄管理,到生產(chǎn)間超過(20~25)d還未生產(chǎn)的,需要核實是否為假孕或已經(jīng)食仔。交配用雄樹鼩每次交配后休息(7~12)d便可繼續(xù)交配使用。交配用雌樹鼩的管理,交配后觸摸孕檢未孕的雌樹鼩可繼續(xù)交配,體質(zhì)欠佳未配的雌樹鼩待恢復(fù)后可再次交配,受孕雌樹鼩生產(chǎn)斷乳后休息2周即可再次交配,未孕雌樹鼩每月有兩次交配受孕機會[11]。
產(chǎn)后檢查產(chǎn)仔數(shù),每天觀察幼仔生長情況;按規(guī)定格式,每日記錄生產(chǎn)狀況,產(chǎn)仔數(shù)在2只或3只時,通常在40日齡時可全部離乳。產(chǎn)仔數(shù)大于3只時,一窩可選擇不同的時期離乳,極個別幼仔可在45 日齡時離乳[12]。
繁育工作的開始,進行情況及種群生長表現(xiàn)狀態(tài)等均要有良好的記錄。每只動物均要有準確詳細的記錄,包括健康情況、血緣關(guān)系等。
在啟用前應(yīng)對設(shè)施、籠具及用具等統(tǒng)一進行徹底消毒。將與外界相通的進出氣孔,電源插座等用膠帶紙封閉,門縫用塑料紙密封,在盛有10%濃度的甲醛液(規(guī)定量40 mL/m3)的容器內(nèi)中加入高錳酸鉀(規(guī)定量30 g/m3)后,放入房間內(nèi)進行熏蒸或用純甲醛加熱熏蒸。操作人員必須迅速退出門外,熏蒸24 h即可;啟封進出氣孔和門窗,自然通風(fēng)7 d[13]。
樹鼩的人工飼養(yǎng)應(yīng)有專用的樹鼩飼養(yǎng)籠具,包括籠具及巢箱,必須每周換一次,保證舒適和衛(wèi)生?;\具皆要求無毒,易消毒、規(guī)格統(tǒng)一,堅固耐用,操作使用方便,經(jīng)濟適用;籠架要求牢固、穩(wěn)定,便于拆卸、組裝,推薦使用實驗室人工飼養(yǎng)繁殖及實驗用樹鼩專用籠具(窩箱和籠子的大小分別為350 mm×168 mm×211 mm和400 mm×380 mm×355 mm),以及獨立換氣樹鼩專用隔離籠具?;\架各部件均選用無毒、無味、無磁性,耐酸、耐堿、易清洗,易消毒、耐高溫、耐高壓的材料制成。其中,主架選用AISI304不銹鋼無縫型材或有縫型材制作,不銹鋼內(nèi)外表面宜電刨光,獨立換氣樹鼩專用隔離籠具的籠盒采用聚砜(PSU)材料,光滑、透明,便于實驗觀察;巢箱采用 PVC 材料[14,15]。
樹鼩飼養(yǎng)室應(yīng)控制好溫度、濕度、通風(fēng)、噪聲、采光及照明等環(huán)境因素[16-18]。最適溫度為(23±l)℃,推薦值為 (23±3)℃,允許范圍為 (23±5)℃;最適濕度為 (50±5)%,允許濕度為40% ~70%,每天打開動物房門窗自然通風(fēng)8~10 h,噪聲<60 dB。采用自然光照采光,避免直射陽光的照射,如用人工照明應(yīng)控制在12 h:12 h或11 h:1 3 h的明暗交替。照度要求室內(nèi)離地面1 m處達到150 lux。
樹鼩飼料多種多樣,有全價營養(yǎng)顆粒料、混合飼料、水果、面包蟲和牛奶?;旌巷暳系呐浞?以100 kg 計算)及制作如下[19-21]:玉米面 32 kg,大米面 10 kg,小麥面 25 kg,豆粕 18 kg,骨粉 1.5 kg,魚粉 1.5 kg,奶粉 8 kg,白糖 4 kg,食鹽 0.2 kg,VC50 g,VE50 g,復(fù)合 VB100 g,煙酸 50 g,葉酸 50 g,VAD50 g,多種維生素50 g,酵母100 g。將主要成分混勻,加水少許攪拌均勻,放入蒸箱蒸40 min即可,待蒸料冷卻后,再添加維生素拌勻即可飼喂。水果用高錳酸鉀水浸泡10 min,清水洗凈切成小塊喂食,面包蟲,純牛奶直接喂。樹鼩正常生長發(fā)育營養(yǎng)需求:水分30%、粗蛋白25%、粗脂肪 6%、無氮浸出物24.5%、粗纖維6%、粗灰分6%、鈣1.5%、磷1%,并補給適量的水果、面包蟲等營養(yǎng)品。懷孕樹鼩營養(yǎng)需求是在普通正常飼料的基礎(chǔ)上補充動物性蛋白 10g/d/只,純牛奶 5 mL/d/只,水果 20 g/d/只。
樹鼩喂食次數(shù)及數(shù)量為每天飼喂蒸料兩次,共50 g/每只。懷孕的樹鼩需每天喂面包蟲20條,牛奶5 mL,水果50 g。飲水可用清潔的自來水加到水盒里。加水時注意水不要沖到樹鼩身上,每天兩次,保證樹鼩每天有充足的飲水。動物房每天打掃1次,清除剩余食物,果皮殘渣及其糞便,窩箱和籠子每月清潔一次,先用消毒藥水浸泡,然后刷洗干凈并晾干,食盒和水盒每周清洗1次。
通過質(zhì)量控制對樹鼩進行檢疫性檢查,了解樹鼩群中發(fā)生某種疾病或發(fā)生傳染病流行,經(jīng)檢測確診病原,采取控制措施,提高對疾病的認識,積累經(jīng)驗和收集病毒株標(biāo)本,其內(nèi)容包括:常規(guī)健康監(jiān)測、寄生蟲檢測、細菌學(xué)診斷及病毒學(xué)檢查[22,23]。每季隨機取樣進行健康監(jiān)測,樹鼩采樣數(shù)根據(jù)飼養(yǎng)的總數(shù)及地方標(biāo)準所規(guī)定的抽檢率決定,待檢樹鼩包含6月齡成年樹鼩與老年的淘汰種樹鼩。常規(guī)定期對所飼養(yǎng)的樹鼩群抽樣進行病毒學(xué)檢查,以了解樹鼩群中病毒感染情況,是否符合原來級別。從樹鼩體內(nèi)分離及培養(yǎng)病原菌,即細菌學(xué)診斷方法,各種致病菌均有一定的特性,因而采樣部位、分離和鑒定方法也不同,目前樹鼩細菌學(xué)檢驗仍使用比較成熟的分離培養(yǎng)法比較準確。
樹鼩被應(yīng)用于人類醫(yī)學(xué)實驗研究的多個領(lǐng)域,如病毒性肝炎、流感病毒、登革熱病毒、輪狀病毒、皰疹病毒、糖尿病、膽結(jié)石、癌癥等各種類型的人類疾病樹鼩模型。由于樹鼩的許多分子和細胞結(jié)構(gòu)近似于人類,對多種人類重要病毒易感,可作為重要人類病毒的動物模型,并在腫瘤學(xué)、內(nèi)分泌學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)、生殖生物學(xué)、免疫學(xué)等方面已有廣泛和深入的研究。世界衛(wèi)生組織(WHO)多年前就呼吁用樹鼩代替大猩猩進行科學(xué)實驗,樹鼩替代黑猩猩作為常用的模式實驗動物已是一種趨勢和必然,并在一定領(lǐng)域具有靈長類明顯的優(yōu)勢[1]。近些年來,已經(jīng)有不少學(xué)者在樹鼩能否作為HCV感染的動物模型方面做了十分有益的探索,為盡快研究HCV丙肝病毒的感染機制、生活周期、致病機制、病理學(xué)變化以及為相關(guān)疫苗和藥物的研制提供科學(xué)可靠的研究平臺。
由于樹鼩實驗動物化研究的長期滯后,在不同程度上影響了樹鼩開發(fā)應(yīng)用研究的進程,實驗樹鼩標(biāo)準化研究滯后是長期以來實驗樹鼩應(yīng)用研究發(fā)展緩慢的主要原因之一。對有關(guān)樹鼩的工作,各個國家及政府應(yīng)給予鼓勵與支持,以國際合作方式解決樹鼩問題的探討已迫不及待。因此,擁有樹鼩自然資源的國家和政府當(dāng)局及科學(xué)家們,有責(zé)任做捕捉、運輸時的動物福利工作,開展實驗樹鼩質(zhì)量控制國家標(biāo)準的研究和近交系實驗樹鼩的培育研究;進一步加強實驗樹鼩的基礎(chǔ)生物學(xué)研究;開展人類重大疾病的樹鼩動物模型的研究;建立國家級實驗樹鼩種源基地、生產(chǎn)供應(yīng)基地和動物實驗研究基地。制定并促進保護與供應(yīng)樹鼩的政策及辦法,同時在其實驗過程中的動物福利問題應(yīng)當(dāng)引起人類的足夠重視。中國近年也已將樹鼩資源的開發(fā)利用提到議事日程并列入國家科技部“十一五”、“十二五”科技支撐計劃項目[24]。在“十二五”期間,通過該項目的實施,促進我國樹鼩實驗動物化和標(biāo)準化進程,將為國家建立和完善樹鼩種質(zhì)資源管理體系、種質(zhì)資源中心和保存基地提供有力支撐,樹鼩最終必將成為一種極具價值和科學(xué)研究需求的新型實驗動物。
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