胡 瑩，劉笑涵，王靖宇，吳 琳，高 勇，張勁松

(1.中國醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院修復科，遼寧省口腔醫(yī)學研究所，沈陽 遼寧 110002;2.中國科學院金屬研究所，沈陽 遼寧 110016)

對腫瘤、炎癥或外傷等原因造成的復雜外形、長段承重骨缺損的修復一直是臨床工作的難題。低強度脈沖超聲波(low-intensity pulsed ultrasound stimulation，LIPUS)是一種加速骨修復，促進骨愈合的非侵入性物理療法。基于臨床實驗的研究結(jié)果，低強度脈沖療法在骨科領(lǐng)域逐漸實現(xiàn)了商業(yè)化，美國食物和藥品管理部門于1994年和2000年相繼批準了在臨床上應用低強度超聲波治療儀治療新鮮骨折和骨不連［1，2］。國內(nèi)外學者關(guān)于 LIPUS對骨折愈合作用機理的研究已逐步深入到分子生物學水平，并認為頻率1.5 MHz、強度 30 mW/cm2、脈沖寬度 200 μs、脈沖周期 1 kHz、20 min/次、1 次 /d 的超聲參數(shù)治療效果最佳［3］。

本實驗利用TiC/Ti泡沫材料修復beagle犬脛骨節(jié)段性骨缺損，LIPUS輻照患區(qū)，利用影像學研究手段及骨密度的測定，分析LIPUS輻照對節(jié)段性骨缺損修復的影響，為評估將LIPUS作為一種輔助治療手段應用到節(jié)段性骨缺損的可行性提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 植入材料:TiC/Ti泡沫材料，孔徑1 mm，孔隙率為80%。規(guī)格:直徑12 mm長20 mm。超聲波清洗3次，高溫高壓滅菌(134℃，0.21 MPa)。

1.1.2 內(nèi)固定器 依據(jù)左側(cè)脛骨中段解剖特征制成帶翼和不帶翼固定板兩種，配套自攻釘、固定釘及其螺帽。帶翼固定板及其對側(cè)不帶翼固定板、自攻釘為低彈性模量鈦鈮鋯錫合金(簡稱Ti-2448鈦合金)材料，固定釘及其螺帽為316L不銹鋼材料。由中國科學院金屬研究所制作提供。超聲波清洗3次，高溫高壓滅菌(134℃，0.21 MPa)。

1.2 實驗動物及實驗環(huán)境

選用6只健康成年 beagle犬，雌性，體重7～8 kg，所用動物均獨立喂養(yǎng)，觀察1周后將健康動物用于實驗。分為超聲組及實驗組兩組，每組3只。動物合格證號為:SYXK(遼)2008-0005。

1.3 植入方法及術(shù)后超聲波輻照

各組犬均以速眠新2號按0.06 mL/kg肌內(nèi)注射麻醉后，綁定、備皮、消毒、鋪巾，2%利多卡因局部浸潤麻醉，于脛骨中段沿骨長軸切開皮膚深達皮下，鈍性分離肌肉和骨膜至骨面，充分暴露術(shù)野，嵌入事先準備好的自制模板，無菌生理鹽水冷卻下利用裂鉆在預定骨截出部位的近遠中各鉆2個孔，4個孔沿脛骨長軸排列在一條直線上，模板控制孔道的方向相互平行。帶翼固定板放入，按植入材料大小截骨制備成全層骨缺損模型，注意保護腓骨和周圍血管肌肉，TiC/Ti材料植入，安放對側(cè)固定板，旋緊螺釘，確保材料與骨斷端間接觸穩(wěn)定。用0.9%的生理鹽水及8萬單位的慶大霉素沖洗術(shù)區(qū)。分層縫合，關(guān)閉切口，消毒皮膚。術(shù)后當日起80萬單位/d青霉素肌肉注射抗菌，連續(xù)3 d。超聲波輻照過程:術(shù)后第3天開始進行術(shù)區(qū)的超聲波輻照，超聲波治療儀由重慶海扶醫(yī)療公司提供。超聲參數(shù):頻率1.5 MHz、強度 30 mW/cm2、脈沖寬度 200 μs、脈沖周期 1 kHz、20 min/次、1 次/d，對照組為不開功率源的假輻照。

1.4 X射線觀察及分析

分別于術(shù)后當天、術(shù)后4周、8周垂直術(shù)區(qū)平面攝脛骨缺損部位X線側(cè)位片，通過骨斷端的模糊程度，內(nèi)外骨痂密度，骨痂生成量對 X線結(jié)果進行評定。

1.5 骨密度測定方法

使用Image-Pro Plus 6.0軟件對每張X線片新生骨平均密度及自身宿主骨平均密度進行測量，利用下面公式計算新生骨痂組織的骨密度值。

新生骨痂組織的骨密度值=新生骨平均密度值 /宿主骨平均密度值

1.6 統(tǒng)計學方法

利用SPSS 13.0軟件采用t檢驗的方法對數(shù)據(jù)進行處理。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 X射線觀察結(jié)果

4周時超聲組骨痂早期成熟度優(yōu)于對照組，表現(xiàn)在材料周圍有骨痂影從兩端向中央形成且密度較高，可見相對完整的骨干;對照組僅見骨痂影密度低，還可見部分骨痂缺如。8周時超聲組新生骨痂面積優(yōu)于對照組，超聲組骨干形成相對穩(wěn)定，對照組對位對線良好，骨斷端骨質(zhì)未閉合，在骨斷端兩側(cè)看到少量的骨痂，愈合較差(圖1)。

(:材料周圍新生骨痂部分)。圖1 X線觀察超聲組及對照組術(shù)后、4周、8周材料周圍骨愈合情況(:New bone callus section around the material).Fig.1 Postoperative X-ray film analysis of the bone formation around the implanted material at 4 and 8 weaks

2.2 骨密度測定結(jié)果

4周時超聲組新生骨痂組織骨密度高于對照組新生骨痂組織骨密度，P＜0.05存在統(tǒng)計學差異;8周時兩組間差異無統(tǒng)計學意義 (表1)。

表1 超聲組及對照組新生骨痂組織骨密度測定比較(mg/cm2，±s)Tab.1 Comparison of bone mineral density rate in the two groups(mg/cm2，±s)

表1 超聲組及對照組新生骨痂組織骨密度測定比較(mg/cm2，±s)Tab.1 Comparison of bone mineral density rate in the two groups(mg/cm2，±s)

注:與對照組相比，aP＜0.05。Note:ap＜0.05，compared with the control group.

超聲組 Ultrasound treatment 0.97±0.02a 0.99±0.01對照組Control 0.91±0.02 0.98±0.02

3 討論

LIPUS是一種非侵入性機械能，經(jīng)皮傳遞后可在生物器官內(nèi)產(chǎn)生高頻率聲波。LIPUS促進骨愈合的可能作用機制可以概括為三個方面。首先，LIPUS可直接影響參與骨愈合過程的一系列細胞信號改變，其產(chǎn)生的剪切力或血流的改變直接作用于細胞膜上的第二信號系統(tǒng)，膜通道開放，鈣離子內(nèi)流增加，具有提高骨密度的潛在效應［4－6］。其次，LIPUS能促進血管內(nèi)皮生長因子-A(VEGF-A)mRNA水平增加，VEGF是血管生成的重要調(diào)節(jié)因子。LIPUS還可刺激肥大軟骨細胞增殖，增強軟骨外基質(zhì)(II型膠原和糖胺聚糖等)的合成及新生骨質(zhì)的成熟程度，促進軟骨內(nèi)化骨的早期出現(xiàn)［7－9］。因此，可以推測本實驗模型經(jīng) LIPUS輻照，各種骨效應細胞活性提高、骨缺損部位血管分布增多、軟骨外基質(zhì)合成增強，加速新骨的形成和礦化。本實驗結(jié)果顯示，超聲組骨痂的成熟先于對照組;4周時超聲組新生骨痂組織骨密度高于對照組，而8周時超聲組與對照組相比骨密度無統(tǒng)計學差異，提示LIPUS對骨形成和礦化的影響在早期。這個結(jié)果與Pilla等人的研究結(jié)果相一致，Pilla等［10］經(jīng)過多次實驗總結(jié)出LIPUS作用于炎癥期和骨痂形成期，在塑性期未發(fā)生作用。

另外，LIPUS還可以通過加快骨重建，改善骨痂結(jié)構(gòu)，增強骨的生物力學性能，發(fā)揮促進骨愈合的作用［11.12］。本課題組將在本實驗的基礎上，通過組織形態(tài)學、生物力學及影像學檢測，進一步評價LIPUS對節(jié)段性骨缺損修復的影響。

由于外傷、腫瘤、感染等原因造成的節(jié)段性骨缺損達到一定長度后即不能形成骨性愈合，因此成為骨科修復領(lǐng)域一大棘手問題，有學者通過建立動物模型對其治療方法進行探討［13］。近年來，隨著生物技術(shù)與臨床實踐相結(jié)合的日益深入，各種生物材料在臨床上已廣泛應用于修復骨組織缺損［14］。本課題組前期實驗已經(jīng)證實泡沫 TiC/Ti具有良好的生物安全性、骨結(jié)合能力、骨傳導性及良好的機械性能，具備成為新一代大段骨缺損修復材料的可能性［15］。本實驗目的在于通過聯(lián)合應用 LIPUS與泡沫TiC/Ti修復beagle犬脛骨節(jié)段性骨缺損，促進新生骨組織的形成，縮短骨愈合時間。LIPUS雖然已被批準應用于臨床骨折及骨不連的治療，但其對節(jié)段性骨缺損的治療作用仍處于初期探索階段，實驗室中建立的骨缺損模型多為小范圍的缺損，如LIPUS對Beagle犬前磨牙牙周骨6 mm深的骨缺損和大鼠顱骨直徑2.7 mm的骨缺損的加速修復［16］。

綜上，本實驗通過TiC/Ti泡沫材料修復 beagle犬脛骨節(jié)段性骨缺損，LIPUS輻照患區(qū)，其影像學結(jié)果證實聯(lián)合應用低強度脈沖超聲波輻照與人工骨材料修復可提高新骨形成速度及骨組織密度，縮短節(jié)段性骨缺損的骨愈合時間。但是本實驗仍存在許多尚待研究的問題:如LIPUS在傳播中由于長骨周圍覆蓋的軟組織、植入材料及其內(nèi)固定器金屬材料的吸收作用而衰減［17］，因此，LIPUS具體治療參數(shù)的選擇及加載周期的制定等方面仍需要實驗驗證。

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［2］US Food and Drug Administration(FDA):Exogen 2000，3000，or Sonic Accelerated Fracture Healing System (SAFHS):Summary of Safety and Effectiveness.Premarket Appreval P900009/Supplement 6.Exogen，Inc，Rockville，MD，US Food and Drug Adminstration，F(xiàn)ebruary 22，2000.

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