王 輝，蔡月琴，李守業(yè)，徐志偉，劉 瓊，壽旗揚，李昌煜

(1.浙江中醫(yī)藥大學，杭州 310053;2.浙江醫(yī)學高等專科學校，杭州 310053)

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是由各種致病因子作用于機體導致胰島功能減退或胰島素抵抗等繼而引發(fā)的一系列代謝紊亂綜合征。近年來，糖尿病中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)并發(fā)癥引起了人們的關注，表現(xiàn)為海馬區(qū)的神經(jīng)炎性反應和神經(jīng)元損傷，造 成 認 知 功 能 障 礙［1，2］。 海 馬 區(qū) 又 名 海 馬 體(hippocampus)，分別位于左右腦半球，是學習、記憶以及空間定位的重要解剖基礎和神經(jīng)中樞。長期高血糖是導致糖尿病慢性并發(fā)癥的重要危險因素，但糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展不僅與血糖升高有關，更與血糖波動幅度增大密切相關。血糖波動性越大慢性并發(fā)癥的發(fā)生率越高，預后越差［3，4］。體外實驗證實，細胞外葡萄糖濃度的上下波動比持續(xù)高糖濃度對細胞的危害更大［5］。且血糖波動可加重對大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元的凋亡［6］。

本研究采用鏈脲佐菌素(STZ)30 mg/kg制備SD大鼠糖尿病模型和持續(xù)高血糖模型，并錯時腹腔注射給予葡萄糖0.375 g/kg和皮下注射胰島素1 U制備糖尿病血糖波動大鼠模型。通過對大鼠的一般生理學和血液生化指標檢測，驗證各組模型;同時檢測大鼠海馬體中 IL－1β、IL－2、IL－6、IL－8、TNF－α等炎性因子mRNA的表達及其對學習、空間記憶功能的影響，綜合評價糖尿病血糖波動模型大鼠海馬體的炎性損傷程度，揭示血糖波動對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及飼養(yǎng)條件

6～8周齡雄性 SPF級SD大鼠60只，體重160～180 g，由上海西普爾必凱實驗動物有限公司提供［SCXK(滬)2008－0016］。溫度(20 ±2)℃，相對濕度50% ～60%，光照12 h明暗交替，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學動物實驗研究中心［SYXK(浙)2008－0115］。

1.2 實驗試劑與儀器

1.2.1 實驗試劑:超短效胰島素諾和銳(YP50503，丹麥諾和銳);鏈脲佐菌素 (20110703－3，Sigma進口分裝);血糖試紙(451289，德國羅氏);RNAiso plus、RT－PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR green熒光定量試劑均購自 TaKaRa公司;高脂飼料:蔗糖 10%、蛋黃10%、豬油10%、膽固醇0.5%、基礎飼料69.5%，由江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限公司提供。

1.2.2 實 驗 儀 器:熒 光 定 量 PCR 儀 (Bio－Rad，IQ5)，生物安全柜(Thermo)，微量核酸測定儀(Thermo，Nano－drop)，定 性 PCR 儀 (Bio－Rad，PTC200)，全自動生化分析儀(Hitachi，7020)

1.3 動物實驗

1.3.1 糖尿病動物制備與篩選:雄性大鼠60只適應性飼養(yǎng)1周，將其隨機分為正常對照組(N)15只和造模組(M)45只，普通飼料飼養(yǎng)6周，所有大鼠自由飲食、飲水。6周后，所有大鼠禁食不禁水16 h，造模組按30 mg/kg體重尾靜脈注射濃度1%的STZ，正常對照組注射等量檸檬酸緩沖液。造模1周后，禁食不禁水16 h，測空腹血糖，挑選血糖值 15.0 mmol/L～20.0 mmol/L的成模大鼠。

1.3.2 血糖波動模型制作:將成模大鼠隨機分為3組:糖尿病模型組(M)、血糖波動組(MF)15只、持續(xù)高血糖(MS)組，每組各10只。以高脂飼料喂養(yǎng)(蔗糖10%、蛋黃10%、豬油10%、膽固醇0.5%、基礎飼料69.5%)。正常對照組(N)、糖尿病模型組(M):給予腹腔注射生理鹽水0.375 g/kg.d體重作為對照，并于注射后30 min測量血糖，連續(xù)6周。糖尿病持續(xù)高糖組(MS):定時給予腹腔注射250 g/L葡萄糖溶液 0.375 g/kg.d體重，造成 1 d中血糖值高于正常血糖值的波動模型，使其血糖值在正常血糖和高血糖間漂移，注射后30 min測血糖，連續(xù)6周。糖尿病血糖波動組(MF):定時給予腹腔注射250 g/L 葡萄糖溶液0.375 g/kg.d體重，錯時30 min后給予腹腔注射超短效胰島素類似物諾和銳，造成1 d中血糖值大幅度波動模型，使其血糖值在高血糖和低血糖間反復漂移，注射后30 min測血糖，連續(xù)6周。

1.4 指標觀察及標本收集

1.4.1 體重測定:每周測定一次大鼠體重。

1.4.2 生化指標:用全自動生化檢測儀測定大鼠血清 Glu、TG、LDL－C 和 HDL－C。

1.4.3 海馬組織 IL－1β、IL－2、IL－6、IL－8、TNF－α 的mRNA檢測:海馬組織剝離:將各組大鼠給予10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，快速斷頭取出腦組織，去掉小腦，沿兩側(cè)大腦半球連接處將大腦半球切開，剝離出海馬，漂洗去血，立即凍于液氮中［7］。

總RNA提取:取海馬組織提取總RNA，操作按照RNAiso Plus(Total RNA提取試劑)說明書進行。實驗過程所用 RNase free槍頭、1.5 mL RNase free離心管購自美國Axygen公司。

RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA:將已提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應操作在冰上進行。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTM RT reagent說明書配置RT反應液，將反轉(zhuǎn)錄反應體系加到無RNase的PCR管內(nèi)，反轉(zhuǎn)錄反應條件:37℃ 15 min，85℃ 5 s。反應結束后，將cDNA保存于－20℃冰箱備用。

Real time RT－PCR:將 cDNA用實時熒光定量PCR儀進行擴增，反應操作在冰上進行，按照熒光定量試劑盒SYBR Premix Ex TaqTMII(Perfect Real Time)說明書配置擴增液，并設置陰性對照。大鼠IL－6、TNF－a、IL－8、IL－1β 和 IL－2 熒光定量 PCR 引物序列由生工?生物工程(上海)有限公司設計并合成，各引物序列如下:

將反轉(zhuǎn)錄反應體系加到用于熒光定量反應的8聯(lián)管內(nèi)，擴增反應條件如下:

預變性:95℃ 3 min;48個循環(huán)(95℃ 10 s，60℃30 s);溶解曲線:從55℃開始，每 30 s升高 0.5℃，直到95℃，循環(huán)1次。

所有反應信息資料由 Bio－Rad iQ5 PCR儀收集，Ct值通過計算機軟件來測量和計算，轉(zhuǎn)錄水平通過公式 2－△△CT計算。

1.4.4 行為學檢測(Morris水迷宮):在血糖波動模型建立后第6周進行水迷宮實驗，每只動物每天訓練2次，共訓練5 d。(1)定位航行實驗:用于檢測大鼠的空間定位和記憶能力，第1天上、下午各訓練1次，入池位置為站臺所對象限及所鄰象限，于象限邊1/2弧度處頭朝池壁入水。120 s內(nèi)未找到站臺者，將其引至站臺，放置30 s，引導其學習與記憶。第2～5天重復上述操作，若120 s內(nèi)仍不能找到站臺，則以120 s計算，不再進行引導。從第2天開始，記錄找到平臺所用時間(逃避潛伏期)。(2)空間探索實驗:在第5天進行，撤除平臺，將大鼠從定位航行實驗的象限邊 1/2弧度處頭朝池壁入水，記錄大鼠60 s內(nèi)在無平臺水迷宮中穿越平臺所在位置的次數(shù)和在平臺所在象限游泳距離。此測試可用于檢測大鼠對平臺位置的記憶。

表1 實時熒光定量PCR引物序列Tab.1 Primer sequence used in the real time quantitative polymerase chain reaction

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 大鼠一般狀況和體重變化

N組和大鼠精神狀態(tài)良好、毛色光亮、攝食攝水量正常、自主活動無異常;MF和M組MS組大鼠出現(xiàn)典型的糖尿病“三多一少”(多食、多飲、多尿、消瘦)癥狀，豎毛無光，蜷縮拱背。表2結果顯示，實驗前各組大鼠體質(zhì)量無顯著性差異(P＞0.05);血糖波動造模第6周時，M組、MS組及MF組大鼠體質(zhì)量顯著低于 N組(P＜0.01)，M 組、MS組及 MF組之間在1%極顯著水平下無差異(P＞0.01)。

2.2 大鼠造模后血液生化指標變化

表3結果顯示，尾靜脈注射 STZ 1周后，M組、MS組、MF組的 Glu、TG、LDL－C 都有顯著性的提高(P ＜0.01)，HDL－C 顯著性下降(P ＜0.01)。其中，M組、MS組、MF組之間各指標差異都無顯著性(P＞0.05)，提示不同糖尿病模型之間的一致性和可比性。模型各組血糖值在 15.0 mmol/L～20.0 mmol/L之間，證明大鼠糖尿2型病模型建立成功。

2.3 大鼠海馬組織中細胞炎性因子mRNA的表達

圖1、2結果顯示，與正常組比較，各模型組海馬組織的 IL－1β、IL－6、IL－8 以及 TNF－α 均呈現(xiàn)顯著性變化(所有 P＜0.05)，組間 IL－2水平差異則無顯著性(P＞0.05)。其中，血糖波動模型 MF組 IL－1β 水平的變化最大，達到極顯著水平(P＜0.01)，亦顯著高于M組和 MS組水平(P＜0.01);M組、MS組中IL－6水平相比正常 N組有顯著升高(P＜0.01)，MF組雖有升高，但未呈顯著性變化(P＞0.05);各模型組IL－8水平比N組均有顯著提高(P＜0.05);TNF－α水平在血糖波動模型MF組中上升最多，呈極顯著變化(P＜0.01)，該水平顯著高于 M組和MS組(P＜0.01)。盡管 IL－2水平在各組間無統(tǒng)計學上的顯著差異，仍可見血糖波動模型MF組中表達水平最低。各指標相關生理學意義將在討論部分具體論述。

表2 各組大鼠體質(zhì)量變化情況(±s，n=10)Tab.2 Variation of body weight in the rats groups(±s，n=10)

表2 各組大鼠體質(zhì)量變化情況(±s，n=10)Tab.2 Variation of body weight in the rats groups(±s，n=10)

注:不同字母代表統(tǒng)計學差異有顯著性:P＜0.01Note:Different letters represent significant difference，P ＜0.01.

組別Groups處死時(血糖波動造模第6周)Animal sacrifice(6 weeks after bloodglucose fluctuation)N 組 190.4 ±7.2 332.9 ± 19.2 357.3 ±34.9 a M 組 193.5 ±3.8 315.9 ± 27.3 298.2 ±26.0 b MS 組 190.3 ±6.9 329.5 ± 17.5 285.2 ±37.2 b MF 組 190.1 ±10.2 330.6 ± 23.3 263.2 ±35.0 b P 值 0.697 0.323 0.0001 F值實驗前(喂高脂前)Before experiment(Before high fat diet feeding)STZ注射前(喂高脂第6周)Before injection with STZ(6 weeks after high fat diet feeding)0.483 1.202 14.379

表3 注射STZ后大鼠血液生化指標Tab.3 Blood biochemical indexes of the rats after injection of streptozoticin

注:不同字母代表統(tǒng)計學有顯著性差異:P＜0.05，P＜0.01。圖1 各組大鼠海馬體中炎性因子IL－1β、TNF－α的mRNA表達水平(n=10)Note:Different letters represent significant difference，P ＜0.05，P ＜0.01.Fig.1 mRNA expression of inflammatory factors IL－1β and TNF－α in the rat hippocampus of each group(n=10)

注:不同字母代表統(tǒng)計學有顯著性差異:P＜0.05，P＜0.01。圖2 各組大鼠海馬體中炎性因子 IL－2、IL－6和IL－8的mRNA表達水平(n=10)Note:Different letters represent significant difference，P ＜0.05，P ＜0.01.Fig.2 mRNA expression of inflammatory factors IL－2，IL－6 and IL－8 in the rat hippocampus of each group(n=10)

2.4 大鼠海馬體功能的變化

通過Morris水迷宮實驗對各組大鼠空間定位和記憶功能的變化進行檢測。如圖3顯示，M組、MS組、MF組的逃避潛伏期、經(jīng)過平臺的次數(shù)以及在平臺象限內(nèi)的游泳距離與N組相比均呈極顯著提高(所有P＜0.01)。其中血糖波動模型MF組的逃避潛伏期和過平臺次數(shù)顯著高于M組和MS組(P＜0.01)，提示 MF組空間定位和記憶功能受損最嚴重。平臺象限內(nèi)的游泳距離在三種糖尿病模型組間差異無顯著性(P＞0.05)。

注:不同字母代表統(tǒng)計學差異有顯著性:P＜0.01。圖3 各組大鼠逃避潛伏期時間和空間探索經(jīng)過平臺位置次數(shù)及在平臺象限游泳的距離(±s，n=10)Note:Different letters represent significant difference，P ＜0.01.Fig.3 The escape latency，number of rats passing hidden platform and the swimming distance in the quadrant of hidden platform of the rats in various groups(±s，n=10)

3 討論

高血糖對糖尿病患者血管的病理損害主要有兩種方式，即慢性持續(xù)性高血糖與波動性高血糖［8，9］。研究表明血糖波動幅度越大，糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)生率越高、預后越差［4］。Eric等研究也認為，相對于空腹血糖來說餐后血糖的急性波動更能預測動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展［10］。目前關于糖尿病血糖波動動物模型的研究較少，本實驗模擬臨床實際情況，設計出餐后高血糖并注射胰島素誘導大鼠血糖波動。

本實驗先對SD大鼠尾靜脈注射30 mg/kg STZ誘導2型糖尿病模型，實驗結果顯示M組、MS組、MF組的血糖值、總膽固醇及低密度脂蛋白都有顯著性提高，而高密度脂蛋白顯著性下降。同時對各組模型大鼠進行生理學和行為學觀察，未見明顯酸中毒或脫水癥狀。表明2型糖尿病大鼠模型建立成功，伴有脂代謝異常。再通過每天2次錯時注射葡萄糖和胰島素造成大鼠血糖劇烈波動建立糖尿病血糖波動模型。該模型的血糖值均在血糖儀可測范圍，具有重復性高，操作簡便等優(yōu)勢。然而與正常組大鼠相比，各模型組大鼠的海馬組織經(jīng)HE染色，病理學特征上差異無顯著性，這可能與本實驗造模時間較短有關。

祖國醫(yī)學將糖尿病歸屬“消渴”范疇。其發(fā)病與體質(zhì)、嗜食肥甘、外感邪毒、勞欲過度、情志內(nèi)傷有關，造成陰精虧損、瘀毒內(nèi)生。近期研究表明，糖尿病是一種先天性免疫和慢性炎癥反應性疾病，是由于高血糖、脂代謝異常等對血管刺激引起體內(nèi)炎癥因子的大量產(chǎn)生。其炎癥反應可歸屬于中醫(yī)的內(nèi)生瘀毒。本實驗表明，各糖尿病模型大鼠海馬組織均產(chǎn)生了不同程度的炎性反應，炎性因子 IL－1β、TNF－α、IL－6、IL－8 等 mRNA 水平顯著改變，將引起海馬體的炎性損傷。IL－1β和TNF－α作為兩種重要的細胞因子，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)由星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞及神經(jīng)元產(chǎn)生，參與神經(jīng)－免疫－內(nèi)分泌網(wǎng)絡的調(diào)控［11］。其中，IL－1β 過表達可激活 HPA 軸導致下丘腦分泌促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子 CRF，后者通過增加神經(jīng)興奮性而造成海馬區(qū)缺血損傷;大量分泌的IL－1β具有可以通過多個環(huán)節(jié)介導神經(jīng)毒性作用，導致腦損傷與神經(jīng)元死亡，包括誘導黏附分子的表達、誘導白細胞的浸潤、促進NOS的合成、誘導氨基酸和自由基的產(chǎn)生、以及啟動多種細胞因子級聯(lián)反應［12］;IL－1β能引起神經(jīng)膠質(zhì)細胞神經(jīng)元網(wǎng)絡結構和功能的損傷，從而導致內(nèi)側(cè)顳葉癲癇［13，14］;IL－1β 還能提高 N－甲基－天門冬氨酸受 體(NMDAR)的活性和NR1(NMDAR1亞基)mRNA的表達，或增加細胞內(nèi)Ca2+濃度而激活Ca2+依賴蛋白酶，促進興奮性腦損傷［15］。TNF－α在神經(jīng)炎性反應和腦損傷中也起到重要作用，能通過改變血腦屏障完整性，使血源性免疫細胞因子進入腦脊液激活小膠質(zhì)細胞，從而釋放更多的炎性因子加重炎性損傷［16］;進一步能通過抑制前列腺素合成促使星形膠質(zhì)細胞釋放谷氨酸，同時抑制星形膠質(zhì)細胞對谷氨酸的再攝取，加重谷氨酸介導的興奮毒性［17］;還可作用于神經(jīng)元導致Caspase的激活，引起神經(jīng)元凋亡。本實驗中，血糖波動模型MF組IL－1β和TNF－α的mRNA相較其他組表達量最高，具有統(tǒng)計學意義(圖1)，提示血糖波動能造成更嚴重的海馬體炎性損傷。有研究表明，海馬體內(nèi)炎性細胞因子尤其是IL－1β和TNF－α表達增多會引起進行性認知功能損害，與海馬內(nèi)神經(jīng)突觸功能及與認知功能有關的神經(jīng)遞質(zhì)受損有關［18，19］。據(jù)此，本研究應用 Morris水迷宮對產(chǎn)生海馬體炎性反應的不同糖尿病模型組大鼠進行檢測，結果發(fā)現(xiàn)炎性反應最嚴重的血糖波動模型MF組的空間定位和記憶功能受損最嚴重(圖3)，進一步說明 IL－1β 和 TNF－α 等細胞因子在血糖波動的情況下將造成更嚴重的海馬體功能損傷。此外，IL－6和IL－8的異常表達也是介導海馬體炎性損傷以及空間記憶功能受損的重要因素，而本實驗中血糖波動模型并未比其他糖尿病模型引起該細胞因子的更高表達，說明血糖波動通過IL－6和IL－8引起的炎性損傷與普通糖尿病以及持續(xù)高糖模型的效果相接近。IL－2在各糖尿病模型組中未見顯著異常表達，提示該細胞因子未參與相關炎性損傷過程。

上述實驗證明，相較急性高血糖和慢性持續(xù)性高血糖而言，波動性高血糖對大腦海馬體造成的炎性損傷更為嚴重，可能引起癲癇、癡呆等神經(jīng)退行性并發(fā)癥。因此，臨床應重視并優(yōu)化糖尿病患者的長期治療方案，避免波動性高血糖的發(fā)生，提高糖尿病患者的生活質(zhì)量和生存周期。

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