李 巍，賀國洋

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院河南省生物精神病學重點實驗室，河南 新鄉(xiāng) 453002;2.新鄉(xiāng)醫(yī)學院病理學教研室，河南 新鄉(xiāng) 453003)

Muc2基因是1989年由美國學者 Gum 等［1］自人小腸cDNA表達文庫中克隆到的一種粘蛋白核心肽基因，后在氣管支氣管黏膜表面又克隆到該基因。定位在11p15.3～15.5上，此基因編譯一種分泌性粘蛋白。粘蛋白Muc2是高分子量的富含糖鏈的糖蛋白，是上皮細胞產(chǎn)生的粘液中主要成分，廣泛分布于消化道黏膜，起保護和潤滑作用。

核心蛋白聚糖(DCN)是存在于細胞周圍基質(zhì)組織中的一種富含亮氨酸的低分子蛋白多糖，以核心蛋白(44 kDa)和蛋白聚糖(72 kDa～130 kDa，smear)兩種形式表達于組織細胞中［2］。DCN參與抑制膠原纖維形成、調(diào)控細胞的增殖和粘附等過程［3］，可能是腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移的重要抑制因子。因此我們從美國芝加哥大學生物學實驗室(University of Illinois at Chicago Biological Laboratory)成功引入了Muc2和DCN基因敲除純合子，通過在SPF級(無特定病原體動物)動物房中飼養(yǎng)、繁殖，為研究 Muc2和 DCN基因在腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移中的功能提供了實驗動物模型。以期了解Muc2和DCN基因?qū)游锷L發(fā)育方面的影響，為該基因敲除品系小鼠的研究應(yīng)用提供背景資料。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物:小鼠從美國(University of Illinois at Chicago Biological Laboratory，USA)購買，雄7只，雌9只，品系為C57BL/6J;基因背景為Muc2基因敲除純合子(Muc2－/－)和 DCN基因敲除純合子(DCN－/－)，在我實驗室 SPF級動物實驗室自行繁殖(SYXK(豫)2009—0002)。

1.1.2 儀器:BCN-1300 II A/B生物潔凈安全柜，蘇州凈化設(shè)備有限公司生產(chǎn);實驗動物自動飲水機，上海摩勒科學儀器有限公司;獨立送風隔離籠具IVC-Ⅱ型，蘇州馮氏實驗動物設(shè)備有限公司。

1.1.3 飼養(yǎng)管理:選擇8周齡的Muc2和DCN基因敲除 C57BL/6小鼠，按雌雄1∶1或1∶2方式交配，長期合籠飼養(yǎng)于SPF級屏障環(huán)境內(nèi)，雌鼠懷孕后期單獨飼養(yǎng)，子代離乳后單獨飼養(yǎng)，用于實驗研究。離乳后的親代雌鼠繼續(xù)按雌雄1∶1或1∶2方式長期合籠飼養(yǎng)于SPF級屏障環(huán)境內(nèi)。室內(nèi)溫度設(shè)定于(20～26)℃;相對濕度30% ～70%;晝夜明暗交替時間為12/12 h。飼料予以河南省實驗動物中心小鼠大鼠生長、繁殖顆粒飼料，飲水由實驗動物飲水機提供，動物自由進食和飲水。墊料為購自河南省實驗動物中心墊料，墊料經(jīng)高溫滅菌，烘干后使用，墊料每周更換2次。飼養(yǎng)用籠具及飲水器每次更換清洗后均使用84消毒液浸泡和75%酒精消毒，動物房每次換完墊料用84消毒液對地板消毒，且每次更換籠具前動物房預(yù)先用紫外線照射30 min消毒。

1.2 方法

1.2.1 繁殖性能的觀察:分別統(tǒng)計 Muc2和 DCN基因敲除小鼠1～3胎平均產(chǎn)仔數(shù)、胎次間隔時間和出生后子代存活率。

1.2.2 出生后親代食子代現(xiàn)象的觀察:分別從Muc2和 DCN基因小鼠1～4胎初生仔鼠中選擇30窩進行食子現(xiàn)象觀察。

1.3 統(tǒng)計學方法

統(tǒng)計學處理所有的數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件進行分析，正態(tài)分布的計量資料以±s表示，組間均數(shù)采用兩獨立樣本t檢驗，計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠的繁殖性能

Muc2純合子6只母鼠成功繁殖出100只子鼠，每胎平均產(chǎn)2～7只幼鼠，每只母鼠胎次間隔時間38～45 d。DCN純合子3只母鼠成功繁殖出33只子鼠，每胎平均產(chǎn)3～5只幼鼠，每只母鼠胎次間隔時間為16～45 d。Muc2和DCN基因敲除的小鼠比較平均產(chǎn)子量和胎次間隔時間均存在明顯差異。結(jié)果如表1。

表1 兩組基因敲除小鼠繁殖性能比較(±s)Tab.1 Comparison of the reproductive performance of gene knockout mice of the two groups(±s)

表1 兩組基因敲除小鼠繁殖性能比較(±s)Tab.1 Comparison of the reproductive performance of gene knockout mice of the two groups(±s)

平均產(chǎn)仔數(shù)(只)Average litter sdize 5.80±0.95 3.85±0.76 10.694 0.00胎次間隔時間(d)Birth interval time 42.29±2.28 24.86±10.42 25.902 0.00

2.2 小鼠食子現(xiàn)象情況

Muc2與DCN基因敲除小鼠在出生后1～3 d存在食子現(xiàn)象(一窩子鼠一旦出現(xiàn)親代食子代現(xiàn)象，最終會把所有子代吃光)，選取18窩Muc2基因敲除小鼠和12窩DCN基因敲除小鼠比較，其中18窩Muc2基因敲除子鼠2窩出現(xiàn)食子現(xiàn)象，共12只子鼠被母鼠吃掉。12窩DCN基因敲除小鼠6窩出現(xiàn)食子現(xiàn)象，15只子鼠被母鼠吃掉。比較Muc2與DCN基因敲除小鼠食子現(xiàn)象和出生后存活率均存在明顯差異。如表2。

表2 兩組基因敲除小鼠食子現(xiàn)象比較Tab.2 Comparison of the differences of kronismus in the two groups of gene knockout mice

3 討論

基因敲除是基因打靶技術(shù)的一種，類似于基因的同源重組。指外源DNA與受體細胞基因組中序列相同或相近的基因發(fā)生同源重組，從而代替受體細胞基因組中的相同/相似的基因序列，整合入受體細胞的基因組中?；蚯贸∈笥捎谕庠椿虻膶攵淖兞俗陨砘蚪M，從而改變一些基因的表達和遺傳形狀。Muc2和DCN是腫瘤相關(guān)基因，參與腫瘤的形成。為了研究Muc2和DCN基因在腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移中的作用，我們從美國引進了一批Muc2和DCN基因敲除的小鼠，來研究與腫瘤的關(guān)系。在飼養(yǎng)觀察中發(fā)現(xiàn)，Muc2基因敲除鼠仔平均產(chǎn)仔量、胎次間隔時間和產(chǎn)后子代存活率均高于DCN基因敲除的小鼠，兩組小鼠存在明顯差異。

Muc2和DCN基因敲除的小鼠來自于C57BL/6J，遺傳背景一樣，由于各自外源DNA的和自身基因的同源重組，發(fā)現(xiàn)他們在繁殖性能方面有差異，提示Muc2和DCN基因不僅是癌癥的相關(guān)基因，可能也影響小鼠的繁殖能力，然而Muc2和DCN基因是通過何種機制影響繁殖能力尚需要進一步研究。

在飼養(yǎng)基因敲除小鼠的過程中，我們觀察發(fā)現(xiàn)母鼠吃子代的現(xiàn)象(食子現(xiàn)象)，食子現(xiàn)在在基因敲除小鼠飼養(yǎng)過程中經(jīng)常出現(xiàn)［4］，很多研究認為是外界環(huán)境因素的影響，比如受到驚嚇、缺水、食物營養(yǎng)供應(yīng)不足、飼養(yǎng)環(huán)境差等因素。在我們的飼養(yǎng)過程中，我們購進的是復(fù)合顆粒飼料，定期喂生葵花籽，保證營養(yǎng)供應(yīng)全面。盡可能減少觀察次數(shù)，飼養(yǎng)人員每次都帶口罩和手套，添加飼料和水前先噴灑醫(yī)用酒精遮蓋外來氣味，避免人為因素引起食子現(xiàn)象。在這樣的前提下，我們發(fā)現(xiàn)Muc2和DCN基因敲除小鼠在食子現(xiàn)象中存在明顯差異，可能外源DNA的同源重組，影響了繁殖先關(guān)的基因，從而引起母鼠遺傳性狀的改變，或者Muc2和DCN基因可能影響母鼠對子鼠的識別能力。由于我們的樣本量小，統(tǒng)計的周期短，可能對結(jié)果也有一定的影響。

總之，除了外在環(huán)境條件(驚嚇、外帶異味、缺乏營養(yǎng)等)的影響，基因敲除小鼠存在食子現(xiàn)象，Muc2和DCN基因敲除小鼠都是來源于品系為C57BL/6J的小鼠，遺傳性狀相同，我們發(fā)現(xiàn)在繁殖性能和食子現(xiàn)象中存在明顯的差異，具體原因尚未明確，有待于進一步研究。

4 結(jié)論

Muc2和DCN基因不僅是癌癥相關(guān)基因，同源重組的Muc2和DCN基因也可能影響小鼠的繁殖性能及對子代的識別能力。

［1］Gum JR，Byrd JR，Hicks JW，et al.Molecular cloning of human intestinal mucins cDNAs［J］.J Biol Chem，1989，26(1 －1):6480.

［2］Goldoni S，Owens RT，McQuillan DJ，et al.Biologically active decorin is a monomer in solution［J］.J Biol Chem，2004，279(8):6606－6612.

［3］Augoff K，Rabczynski J，Tabola R，et al.Immunohistochemical study of decorin expression in polyps and carcinomas of the colon［J］.Med Sci Monit，2008，14(10):CR530 － CR535.

［4］喬錄新，徐萌，柴夢音，等.p53基因敲除小鼠的飼養(yǎng)繁殖及鑒定［J］.實驗動物科學，2012，2:100－102.