禹文海，和占龍，魯紹雄，魯帥堯，趙 遠(yuǎn)，楊鳳梅，李艷艷，陳麗雄，王俊斌，沈 冬

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，昆明 650118;2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明 650201)

微衛(wèi)星DNA(microsatellite DNA)，也稱為簡(jiǎn)單序列重復(fù)(simple sequence repeat，SSR)、短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeat，STR)，在生物基因組中一般以1～6個(gè)堿基為其核心序列、首尾相連組成串聯(lián)核苷酸重復(fù)序列。由于核心序列重復(fù)數(shù)目的不同，產(chǎn)生了DNA多態(tài)性。微衛(wèi)星DNA標(biāo)記與其它分子標(biāo)記相比，具有數(shù)量多、分布廣、多態(tài)性豐富、共顯性遺傳、選擇中性、易檢測(cè)、重復(fù)性好、可提供高分辨率的遺傳信息等特點(diǎn)，是一種理想的分子標(biāo)記，已廣泛應(yīng)用于群體遺傳結(jié)構(gòu)研究和遺傳多樣性分析［1－5］。恒 河 猴 (Macaca mulatta)，為 靈 長(zhǎng) 目(Primates)猴科(Cercopithecidae)獼猴屬的一個(gè)種，是非人靈長(zhǎng)類中分布范圍最廣、數(shù)量最多的一個(gè)類群。國(guó)內(nèi)外通過(guò)人工馴養(yǎng)繁殖，已建立了許多人工飼養(yǎng)繁殖種群，被廣泛地應(yīng)用到醫(yī)學(xué)和生物學(xué)等研究領(lǐng)域。中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所全國(guó)醫(yī)學(xué)靈長(zhǎng)類研究中心開(kāi)展人工飼養(yǎng)、馴化繁殖恒河猴已有50多年的歷史，本研究從該中心人工飼養(yǎng)繁殖的2000余只恒河猴群體中隨機(jī)抽取60只，利用19個(gè)微衛(wèi)星DNA標(biāo)記對(duì)該恒河猴群體進(jìn)行遺傳多樣性檢測(cè)，以期獲得現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)恒河猴種群的遺傳概貌信息及建立一種對(duì)恒河猴群體有效的遺傳監(jiān)測(cè)方法，并對(duì)現(xiàn)有繁育方式作出評(píng)價(jià)，從分子遺傳角度指導(dǎo)該恒河猴群體今后開(kāi)展合理、科學(xué)的遺傳繁育。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和基因組DNA提取

隨機(jī)抽取人工飼養(yǎng)繁殖的普通級(jí)恒河猴共60只，雌雄各半，來(lái)源于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所全國(guó)醫(yī)學(xué)靈長(zhǎng)類研究中心【實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證:(滇)SCXK2010—0006】。股靜脈抽取全血2 mL，EDTA抗凝。采用 AXYGEN DNA提取試劑盒提取基因組DNA，詳細(xì)操作步驟見(jiàn)說(shuō)明書(shū)。

1.2 主要試劑和儀器

PCR 儀(BIO－RAD 公司，美國(guó))，垂直電泳槽、電泳儀和凝膠成像系統(tǒng)(北京六一儀器廠，中國(guó));Sony數(shù)碼相機(jī)(Sony公司，日本)。DNA提取試劑盒(愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)有限公司，中國(guó))，2×PCR Master Mix、DL2000及聚丙烯酰胺凝膠電泳相關(guān)試劑(天根生化科技有限公司，中國(guó))。

1.3 引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增

自 NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/unists)查取19個(gè)微衛(wèi)星 DNA標(biāo)記，由生工生物工程(上海)有限公司合成，各微衛(wèi)星標(biāo)記在染色體上的分布等信息見(jiàn)表1。

PCR反應(yīng)體積為 25 μL，引物 F和 R各(20 μM/L)1 μL，模板 DNA 1 μL，2 × PCR Master Mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR 反應(yīng)條件為 95 ℃ 預(yù)變性6 min;然后94℃變性1 min，54℃ ～65℃退火45 s，72℃延伸 1 min，35個(gè)循環(huán);最后 72℃延伸10 min;4℃終止反應(yīng)。

1.4 電泳及結(jié)果記錄

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)效果后，取4 μL與上樣緩沖液混合后在8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠上60V電泳16h，硝酸銀染色后用氫氧化鈉顯色，條帶清晰后用10%的乙酸終止，最后用凝膠成像系統(tǒng)和Sony數(shù)碼相機(jī)雙重照相。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

用BioRad凝膠成像系統(tǒng)對(duì)8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳圖帶進(jìn)行分析，確定其核苷酸條帶分子量大小，以大小不同的擴(kuò)增片段為不同的等位基因，按等位基因從小到大的順序分別依次定名為A、B、C、D、E、F 等。用 POPGENE Version 1.32 軟件計(jì)算出各座位的觀察雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、等位基因頻率(gene frequency)、觀察等位基因數(shù)(observed number of alleles，Na)、有效等位基因數(shù)(effective number of alleles，Ne)、香 隆 信 息 指 數(shù)(shannon’s information index，I)等指標(biāo)，并根據(jù)Botstein等的公式利用 Excel計(jì)算多態(tài)信息含量(polymorphism information content，PIC)。

使用 POPGENE Version 1.32軟件對(duì)各座位進(jìn)行連鎖分析，根據(jù)座位等位基因的數(shù)目多少，應(yīng)用完全計(jì)數(shù)或馬爾科夫鏈法檢驗(yàn)群體的 Hardy－Weinberg遺傳平衡狀態(tài)。

表1 微衛(wèi)星DNA標(biāo)記的相關(guān)信息Tab.1 The information ofmicrosatelliteDNA markers

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果檢測(cè)

對(duì)19個(gè)微衛(wèi)星座位的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，本文以D4S1645座位的電泳圖譜為例說(shuō)明(圖1)。

注:M:DL2000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，1～22:樣品編號(hào)。圖1 D4S1645座位PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果Note:M:DL2000 DNA marker，1 ～22:Number of samples.Fig.1 The PAGE image of PCR products at D4S1645 locus

2.2 群體遺傳多樣性分析

根據(jù)各微衛(wèi)星座位的基因型，計(jì)算出各座位觀察等位基因數(shù)及其頻率、有效等位基因數(shù)、觀察雜合度，結(jié)果見(jiàn)表2。19個(gè)微衛(wèi)星座位均呈現(xiàn)出了多態(tài)性，共檢測(cè)到了觀察等位基因164個(gè)。各座位的觀察等位基因數(shù)在6～11個(gè)之間，平均為8.6316個(gè)。各基因座位的有效等位基因數(shù)在 3.5727 ～8.9416個(gè)之間，平均為6.0709個(gè)。觀察等位基因數(shù)最多的座位是 D4S1645、D5S1470和 D13S894，有11個(gè)等位基因;觀察等位基因數(shù)最少的座位是D19S210和D16S3106，有6個(gè)等位基因。

表2 恒河猴群體19個(gè)微衛(wèi)星座位的等位基因信息Tab.2 Allele information at 19 microsatellite loci of Macaca mulatta population

表3 恒河猴群體19個(gè)微衛(wèi)星座位的遺傳多態(tài)性Tab.3 The genetic diversity measured at 19 microsatellite loci of Macaca mulatta population

利用POPGENE version 1.32軟件計(jì)算出各微衛(wèi)星座位的觀察雜合度、期望雜合度、香隆信息指數(shù)等指標(biāo)，結(jié)果見(jiàn)表3。各個(gè)微衛(wèi)星座位的觀察雜合度在0.2560 ～ 0.6364 之間，群體平均值為 0.4309，其中，D5S1470座位最高，D19S210座位最低;期望雜合度在 0.7230 ～ 0.9010 之間，群體平均值 為 0.8270，D13S894座位最高，D16S3106座位最低;多態(tài)信息含量在 0.6771 ～ 0.8874 之間，群體平均值為 0.7979，D3S1768座位最高，D16S3106座位最低;香隆信息指數(shù)在 1.4249 ～ 2.2662 之間，群體平均值為 1.8901，D5S1470座位最高，D16S3106座位最低。

采用 POPGENE version 1.32軟件計(jì)算恒河猴群體每個(gè)微衛(wèi)星座位Hardy－Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)的精確P值，結(jié)果顯示，本研究檢測(cè)的19個(gè)微衛(wèi)星座位均偏離 Hardy－Weinberg平衡(P ＜0.01)。

3 討論

群體的遺傳多樣性通常用多個(gè)基因座位遺傳多樣性參數(shù)的平均值來(lái)描述，其重要指標(biāo)主要有群體平均等位基因數(shù)、平均有效等位基因數(shù)、平均觀察雜合度、平均期望雜合度、平均多態(tài)信息含量等［6］。本實(shí)驗(yàn)中各微衛(wèi)星座位的觀察等位基因數(shù)平均為8.6316個(gè);有效等位基因數(shù)平均為6.0709個(gè);多態(tài)信息含量平均值為0.7979，各微衛(wèi)星座位多態(tài)信息含量均大于0.5，均屬于高度多態(tài)性座位(當(dāng)PIC＞0.5時(shí)，為高度多態(tài)性座位);各個(gè)微衛(wèi)星座位的觀察雜合度群體平均值為0.4309;期望雜合度群體平均值為0.8270。由此可見(jiàn)，本實(shí)驗(yàn)所研究恒河猴群體等位基因數(shù)多、多態(tài)信息含量高、雜合度大，說(shuō)明群體內(nèi)基因型一致性差，遺傳變異大，遺傳多樣性豐富。所研究恒河猴群體有如此豐富的遺傳多樣性，追溯原因有以下兩點(diǎn):一是恒河猴群體遺傳基礎(chǔ)廣泛，他們的祖先來(lái)源于云南的鎮(zhèn)沅、景東、楚雄、保山等多個(gè)地區(qū);二是多年來(lái)開(kāi)展的遺傳繁育方式較合理，避免了近交系數(shù)的上升。

本研究檢測(cè)的19個(gè)微衛(wèi)星座位均偏離Hardy－Weinberg平衡(P＜0.01)，說(shuō)明本研究檢驗(yàn)的恒河猴群體存在雜合子缺失的現(xiàn)象。打破平衡的因素有突變、選擇、隨機(jī)遺傳漂變、遷移和遺傳異質(zhì)性等，本研究19個(gè)微衛(wèi)星座位均處于 Hardy－Weinberg不平衡狀態(tài)，主要原因可能是群體處于非隨機(jī)交配體制中，存在一定程度的人工選擇。

微衛(wèi)星DNA標(biāo)記技術(shù)已在近交系大小鼠遺傳監(jiān)測(cè)、親子鑒定及法醫(yī)鑒定中得到了有效的應(yīng)用［7－10］。本研究從大量的微衛(wèi)星DNA座位中選擇分布在不同染色體上的19個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記，利用這些微衛(wèi)星引物對(duì)隨機(jī)抽取的60只人工飼養(yǎng)繁殖的恒河猴個(gè)體進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示各微衛(wèi)星座位均能夠擴(kuò)增出目的條帶，電泳條帶清楚可辨，呈現(xiàn)明顯的DNA多態(tài)性，說(shuō)明所選擇的微衛(wèi)星標(biāo)記具有一定的代表性，能反映出個(gè)體間的遺傳概貌，可以有效的進(jìn)行恒河猴群的遺傳質(zhì)量監(jiān)測(cè)。但本研究中樣品較少，不足以完全反映出群體的遺傳多樣性，有必要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，并對(duì)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)一步完善，建立標(biāo)準(zhǔn)的恒河猴遺傳監(jiān)測(cè)分子生物學(xué)方法，定時(shí)監(jiān)測(cè)恒河猴群體遺傳多樣性狀況，了解群體遺傳多樣性的變化趨勢(shì)，從而指導(dǎo)人們進(jìn)行合理的恒河猴遺傳資源保護(hù)和利用。

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