巨英超，謝 英，劉 超，吳建華，劉樹(shù)鋒

(1.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心2.河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物重點(diǎn)研究室，河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部，石家莊 050017)

斑馬魚(yú)作為一種新型的模式生物，正逐漸拓展和深入應(yīng)用到生命科學(xué)各個(gè)領(lǐng)域的研究中。盡管斑馬魚(yú)作為國(guó)際上應(yīng)用最廣的實(shí)驗(yàn)魚(yú)類(lèi)，但其作為實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物尚未實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化。隨著我國(guó)實(shí)驗(yàn)斑馬魚(yú)應(yīng)用范圍的拓展和深入，斑馬魚(yú)的標(biāo)準(zhǔn)化研究顯得越來(lái)越重要［1－4］。目前國(guó)內(nèi)已經(jīng)有了斑馬魚(yú)資源信息網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)，可以為斑馬魚(yú)基因組及生物信息學(xué)分析提供參考依據(jù)［5］，有關(guān)斑馬魚(yú)的人工繁殖、生態(tài)、生理等方面也已有報(bào)道［6－7］，國(guó)內(nèi)學(xué)者已經(jīng)就斑馬魚(yú)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)化工作開(kāi)展了研究［8］，但是就飼養(yǎng)密度對(duì)斑馬魚(yú)生長(zhǎng)發(fā)育與存活的影響方面則未見(jiàn)報(bào)道。本文將就此進(jìn)行探討，以期為實(shí)驗(yàn)室斑馬魚(yú)相關(guān)研究工作及斑馬魚(yú)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)化提供一些基礎(chǔ)資料和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

AB品系斑馬魚(yú)引自北京大學(xué)生命科學(xué)研究院，飼養(yǎng)于河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心斑馬魚(yú)實(shí)驗(yàn)室自制的斑馬魚(yú)養(yǎng)殖系統(tǒng)，自動(dòng)控制光照，晝夜時(shí)間交替為14 h∶10 h。養(yǎng)殖系統(tǒng)中獨(dú)立飼養(yǎng)單元的容積為3 L，水溫(28.3 ±0.17)℃，pH 值(7.5±0.02)，電導(dǎo)率(1.07 ±0.06)ms/cm，NH4+－N ＜0.04 mg/L［9］。

1.2 方法

試驗(yàn)分為 5 個(gè)組，密度分別為 1、2、4、6、8Tail/L。孵化后的幼魚(yú)14 d之前飼養(yǎng)于1000 mL燒杯中，28℃水浴。4～10 d飼喂草履蟲(chóng)(Paramoecium)，11 d開(kāi)始加入豐年蝦(Artemia)進(jìn)行混合飼喂，并逐日增加豐年蝦的比例。14 d后按組別轉(zhuǎn)移到容量為3 L的獨(dú)立飼養(yǎng)單元內(nèi)，只投喂豐年蝦;每天8∶00、18∶00投食，飼喂量為每條魚(yú) 0.4 mL 用純凈水1∶3稀釋的豐年蝦［10］。20 d起每 10 d測(cè)量一次體長(zhǎng)和體重，90 d時(shí)處死魚(yú)只后分別測(cè)量體重、體長(zhǎng)、心臟重量、肝臟重量并計(jì)算生長(zhǎng)指數(shù)和臟器指數(shù)，比較各組的生長(zhǎng)發(fā)育情況。

1.3 參數(shù)計(jì)算與數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

參數(shù)計(jì)算公式:

日增重(DWG)DWG=(W2－W1)/(t2－t1);

增重率(WGR)WGR=(W2－W1)/W1×100%;

增長(zhǎng)率(LGR)LGR=(L2－L1)/L1×100%;

所有公式中，W1、W2為時(shí)間 t1、t2時(shí)的體重(mg)，L1、L2為時(shí)間 t1、t2時(shí)的體長(zhǎng)(mm)。根據(jù)lietal(2000)的計(jì)算方法，成年魚(yú)臟器指數(shù)=臟器重量(mg)/成年魚(yú)體重(mg)×100%。

所有數(shù)據(jù)使用 SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，方差分析。

表1 斑馬魚(yú)不同飼養(yǎng)密度的生長(zhǎng)參數(shù)(±s)Tab.1 The growth parameters of the zebrafish in different rearing density

表1 斑馬魚(yú)不同飼養(yǎng)密度的生長(zhǎng)參數(shù)(±s)Tab.1 The growth parameters of the zebrafish in different rearing density

初始體重/mg Initial weight 2.51±0.06a 2.36±0.07a 2.42±0.05a 2.41±0.06a 2.67±0.74a最終體重/mg Final weight 167.74±0.78a 162.63±0.65a 184.38±0.62a 108.29±0.98b 68.65±1.32c初始體長(zhǎng)/cm Initial length 0.43±0.01a 0.40±0.01a 0.41±0.001a 0.41±0.01a 0.42±0.01a最終體長(zhǎng)/cm Final length 2.65±0.16a 2.68±0.15a 2.76±0.09a 2.32±0.19b 1.86±0.22c DWG/mg×d－1Daily weight gain 2.36±0.02a 2.29±0.02a 2.60±0.02a 1.51±0.03b 0.946±0.03c WGR/%Weight gain rate 65.83±2.48a 67.91±3.18a 75.19±2.83a 43.93±4.60b 24.71±4.88c LGR/%Length gain rate 5.16±0.87a 5.70±0.97b 5.73±0.67b 4.66±0.95c 3.43±1.24d

表2 斑馬魚(yú)不同飼養(yǎng)密度的存活率Tab.2 The survival of the zebrafish in different rearing density

表3 斑馬魚(yú)不同飼養(yǎng)密度下90日齡的臟器指數(shù)(±s)Tab.3 The viscera index of zebrafish at 90 days of age in different breeding density

表3 斑馬魚(yú)不同飼養(yǎng)密度下90日齡的臟器指數(shù)(±s)Tab.3 The viscera index of zebrafish at 90 days of age in different breeding density

注:以上三表同一行中參數(shù)右上角處字母(a-d)相同代表差異性不顯著(P＞0.05)，不同則差異性極顯著(P＜0.01)。Note:The values with same letters mean no significant difference in a line above three charts(P ＞0.05)，and with different letters mean extremely difference(P ＜0.01).

臟器指數(shù)/%Viscera index 心臟 Heart 5.70±0.14a 5.74±0.21a 5.89±0.15a 4.87±0.19b 4.62±0.26b肝臟Liver 1.67±0.06a 1.58±0.08a 1.70±0.06a 0.96±0.09b 0.85±0.17b

2 結(jié)果

2.1 飼養(yǎng)密度與生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)系

通過(guò)表1可以看出，飼養(yǎng)密度在1至4Tail/L之間，其最終體重、體長(zhǎng)、DWG、GBW 略有變化，當(dāng)養(yǎng)殖密度為4Tail/L時(shí)達(dá)到最大值 ，但各組間差異不顯著。當(dāng)進(jìn)一步增加飼養(yǎng)密度時(shí)，各指標(biāo)反而下降，8Tail/L組的生長(zhǎng)速度、最終體重顯著低于其它組。從圖1(彩插2)的結(jié)果中可發(fā)現(xiàn)，在6Tail/L和8Tail/L組，魚(yú)只的體重增長(zhǎng)趨勢(shì)在后期都明顯表現(xiàn)放緩的跡象。日常飼養(yǎng)工作中觀察該組的魚(yú)只，發(fā)現(xiàn)體型也明顯較其他組瘦弱。

圖1 不同飼養(yǎng)密度下斑馬魚(yú)體重與體長(zhǎng)增長(zhǎng)曲線(xiàn)圖Tig.1 The curve graph of length and weight gain of the zebrafish in different rearing density

2.2 密度對(duì)存活率的影響

1Tail/L、4Tail/L 兩組未見(jiàn)死亡，2Tail/L、6Tail/L兩組只在個(gè)別平行組中出現(xiàn)了1、2尾死亡，而8Tail/L組中幾乎每個(gè)平行組都有2～5尾斑馬魚(yú)死亡，91.81%的存活率也明顯的低于其他組。

2.3 密度與成年魚(yú)臟器指數(shù)的關(guān)系

統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示高密度組的各臟器指數(shù)都顯著降低(表3)。解剖顯微鏡下觀察，1、2、4Tail/L組中斑馬魚(yú)的心臟和肝臟都比6Tail/L、8Tail/L組的要明顯，而且高密度組有很多斑馬魚(yú)很難找到肝臟，主要因?yàn)楦闻K顏色太淺無(wú)法判斷準(zhǔn)確。

3 討論

一般認(rèn)為，魚(yú)類(lèi)的最終體重和日增重都隨著養(yǎng)殖密度的增大而顯著降低［11－13］，但有報(bào)道認(rèn)為，在適宜的飼養(yǎng)密度范圍內(nèi)，較高的飼養(yǎng)密度有利于其生長(zhǎng)。如Baker等對(duì)紅點(diǎn)鮭的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)飼養(yǎng)密度低于40～50 kg/m3時(shí)，紅點(diǎn)鮭的生長(zhǎng)率隨飼養(yǎng)密度增大而呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，但隨著飼養(yǎng)密度的進(jìn)一步增大，超過(guò)40～50 kg/m3時(shí)，魚(yú)類(lèi)個(gè)體的活動(dòng)空間受到限制，繼而間接導(dǎo)致魚(yú)類(lèi)個(gè)體的生長(zhǎng)受到限制，生長(zhǎng)率明顯下降。

在本試驗(yàn)中，4Tail/L以下密度組的斑馬魚(yú)生長(zhǎng)發(fā)育無(wú)明顯差異，4Tail/L密度組的相對(duì)生長(zhǎng)效果較其它組具有優(yōu)勢(shì)，成活率也高。密度過(guò)高則不利于斑馬魚(yú)的生長(zhǎng)發(fā)育，在高密度組普遍存在2～5尾較其他魚(yú)體型明顯小很多的魚(yú)，這在一些報(bào)道中也有提到［14－16］，究其原因可能是在高密度飼養(yǎng)條件采食競(jìng)爭(zhēng)激烈，少量魚(yú)只的采食量不能滿(mǎn)足其生長(zhǎng)發(fā)育的需要。而且過(guò)高的飼養(yǎng)密度也會(huì)引起飼養(yǎng)水體代謝產(chǎn)物的濃度加大，不利于魚(yú)只的生存。考慮到飼養(yǎng)空間利用率等因素，建議將飼養(yǎng)密度確定為4Tail/L。

此前，The Zebrafish Book中曾指出斑馬魚(yú)的飼養(yǎng)密度不應(yīng)超過(guò)25Tail/45L即0.6Tail/L的密度，否則魚(yú)只的生長(zhǎng)發(fā)育將受到嚴(yán)重影響［10］。王天奇等也曾指出，成魚(yú)飼養(yǎng)密度不應(yīng)超過(guò)1Tail/L，幼魚(yú)不應(yīng)超過(guò)2Tail/L［8］。不同的研究結(jié)果可能是研究者采用不同的飼養(yǎng)繁育體系水處理效果的差異而致。本研究的結(jié)果反映了繁育設(shè)備中水環(huán)境對(duì)實(shí)驗(yàn)用魚(yú)生長(zhǎng)發(fā)育的重要性，提示高效的飼養(yǎng)繁育體系及合理的密度有利于斑馬魚(yú)正常的生長(zhǎng)發(fā)育。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)對(duì)不同飼養(yǎng)密度下斑馬魚(yú)的生長(zhǎng)性能指標(biāo)進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)4Tail/L時(shí)斑馬魚(yú)有著較好的生長(zhǎng)發(fā)育優(yōu)勢(shì)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)飼養(yǎng)密度過(guò)高不利于斑馬魚(yú)的生長(zhǎng)發(fā)育。斑馬魚(yú)作為一種新興的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，其標(biāo)準(zhǔn)化工作是必然的趨勢(shì)，穩(wěn)定的環(huán)境、嚴(yán)格的管理須配合合理的飼養(yǎng)密度才能實(shí)現(xiàn)其標(biāo)準(zhǔn)化。對(duì)于規(guī)模較小的實(shí)驗(yàn)室，在條件有限的情況下，合理的飼養(yǎng)密度對(duì)取得真實(shí)可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)極為重要。

(本文圖1，見(jiàn)彩插2)

［1］吳思，趙德明，孫德明，等.實(shí)驗(yàn)用斑馬魚(yú)主要疾病及其實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)化研究過(guò)程面臨的主要問(wèn)題［J］.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)，2009，26(4):51－56.

［2］孫德明，穆苑，高昌，等.模型動(dòng)物斑馬魚(yú)及其特定病原凈化［J］.中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志，2009，19(12):52 －60.

［3］賈順姬，孟安明.中國(guó)斑馬魚(yú)研究發(fā)展歷程及現(xiàn)狀［J］.遺傳，2012，34(9):1082 －1088.

［4］程烽，陳竺.斑馬魚(yú):一種造血系統(tǒng)的遺傳學(xué)研究模型動(dòng)物［J］.國(guó)外醫(yī)學(xué)輸血及血液學(xué)分冊(cè)，2004，27(3):200 －202.

［5］陳寶增，李鳳超，康現(xiàn)江.實(shí)驗(yàn)室斑馬魚(yú)的繁育與養(yǎng)殖技術(shù)［J］.河北漁業(yè)，2008，(4):51 － 53.

［6］陳曉倩，殷浩文.斑馬魚(yú)飼養(yǎng)循環(huán)裝置中的水生環(huán)境微生物群落代謝［J］.中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志，2007(17):110－114.

［7］陳桑，李朝紅，李志華，等.斑馬魚(yú)實(shí)驗(yàn)室繁育系統(tǒng)的建立［J］.中山大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)科學(xué)版)，2006，(27):81 －82.

［8］王天奇，孫榮澤，孫德明.實(shí)驗(yàn)用魚(yú)類(lèi)的水環(huán)境及其標(biāo)準(zhǔn)化［J］.中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志，2009，19(12):44 －51.

［9］謝英，梁衛(wèi)華，張曼，等.一種方便實(shí)用的實(shí)驗(yàn)室斑馬魚(yú)飼養(yǎng)系統(tǒng)［C］.第十屆中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)年會(huì)論文集，揚(yáng)州，2012:253－257.

［10］Westerfield M.The Zebrafish Book:A Guide for the aboratory Use of Zebrafish(Danio rerio)［M］，4th edition.University of Oregon Press，2000.

［11］Daniel Scholfield，B.S.Information Resources on Zebrafish［M］.2010(46).

［12］Kent ML，Spitsbergen JM，Matthews JM，etal.Diseases of Zebrafishin Research Facilites［M］. ZIRC Health Services Zebrafish Disease ManualCulfBreeze.Florida US:US Environmental Protection Agency.2007.

［13］Helfman G，Collette B，F(xiàn)acey D.The Diversity of Fishes［M］.MA，Black well Pub lishing Company，1997:528.

［14］顧新國(guó).斑馬魚(yú)的飼養(yǎng)與繁殖［J］.河北漁業(yè)，2007，(12):30－31.

［15］Christian Lawrence.The huabandary of zebrafish(Danio rerio):A review.Aquaculture［M］，2007，269:1 －20.

［16］陳春娜，黃穎穎，陳先均.養(yǎng)殖密度對(duì)長(zhǎng)薄鰍稚魚(yú)生長(zhǎng)的影響［J］.當(dāng)代水產(chǎn)，2011，(6):65 －68.