殷昆侖，張長勇，王天奇，暴 國，付淑霞，何嘉玲，孫德明

(1.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院，北京 100730;2.國家人口計生委科學(xué)技術(shù)研究所，北京 100081)

生長分化因子9(growth differentiation factor 9，GDF－9)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白15(bone morphogenetic protein 15，BMP－15)是由卵母細(xì)胞分泌的兩種生長因子，對哺乳動物的正常生殖能力是不可或缺的［1］。GDF－9和BMP－15均屬于轉(zhuǎn)錄生長因子β(transforming growth factor beta，TGFβ)超家族蛋白中的成員，其中GDF－9是第一個被證實與卵泡發(fā)育相關(guān)的基因。在小鼠，缺失基因GDF－9時卵泡發(fā)育被阻止在早期階段而導(dǎo)致不孕［2］，此后不久，在綿羊中多種BMP－15基因突變被認(rèn)為是潛在的導(dǎo)致卵泡發(fā)育改變和不孕的因素［3，4］。目前許多研究已經(jīng)證明GDF－9是控制綿羊高產(chǎn)仔的主效基因之一，Hanrahan等［4］將 Belclare綿羊和 Cambridge綿羊 GDF－9 基因編碼區(qū)1184bp處的堿基突變(C→T)命名為G8突變，將BMP－15718處堿基突變718處堿基突變(C→T)命名為B2突變，同時將Belclare綿羊的BMP－15基因1100處的堿基突變(G→T)命名為 B4突變。Hanrahan等［4］發(fā)現(xiàn) X 染色體上 BMP－15基因的突變和5號染色體上GDF－9基因的突變，與高繁殖力綿羊品種Belclare和Cambridge雜合攜帶母羊的高排卵數(shù)和純合子不育相關(guān)聯(lián)。GDF－9在小鼠定位于11號染色體的 29.0cM 處［5］，全長 4618bp，包含兩個外顯子，其中外顯子1的編碼區(qū)是397bp，外顯子2的編碼區(qū)是926bp，共同編碼一種由441個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，其成熟C－末端片段由135個氨基酸殘基組成，與綿羊的同源性為66%［6］。而 BMP－15定位于 X染色體的2.81 cM，全長6618bp，同樣也是兩個外顯子，其中外顯子1的編碼區(qū)是322bp，外顯子2的編碼區(qū)是857bp，共同編碼一種由392個氨基酸組成的蛋白質(zhì)。其特性與GDF9相似。本研究以高繁殖力小鼠(ICR)和低繁殖力小鼠(BALB/c)為實驗材料，研究基因GDF－9和BMP－15在兩種小鼠中的多態(tài)性，旨在找出與小鼠高繁殖力相關(guān)的SNP，為小鼠高繁殖力的標(biāo)記輔助選擇和育種提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 實驗動物

ICR 小鼠，SPF 級(specific－pathogen free，SPF)，雌雄各20只，雌鼠6周齡，雄鼠8周齡，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，許可證號【SCXK(京)－2010－0002】。BALB/c 小鼠，SPF 級，雌雄各20只，雌鼠6周齡，雄鼠8周齡，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，許可證號【SCXK(京)－2009－0007】。并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.2 主要試劑

全血基因組提取試劑盒、Taq酶、dNTPs(10mM)、DNA Marker2k均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;內(nèi)切酶KpnI、XhoI購自寶生物工程(大連)有限公司;瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司;Dual－Luciferase? Reporter Assay System劑盒(Promega公司，美國);Lipofectamine? 2000 Transfection Reagent(Invitrogen公司，美國);測序由北京六合華大基因科技股份有限公司完成。

1.3 方法

1.3.1 小鼠繁殖

購回實驗動物動物為SPF級別，適應(yīng)飼養(yǎng)兩周及實驗均在 SPF級動物室進(jìn)行【SYXK(京)2009－0033】，每一品系雌雄各20只隨機配對，以產(chǎn)仔5胎來計算平均生殖能力，具體統(tǒng)計指標(biāo)包括產(chǎn)仔數(shù)、離乳數(shù)和胎間隔時間。

1.3.2 小鼠全血基因組DNA提取

在同一時期對不同組別的每只小鼠進(jìn)行尾靜脈采血，用EDTA抗凝，并使用全式金基因組試劑盒提取基因組DNA，用去離子水溶解，測濃度和OD值后，瓊脂糖凝膠電泳，保存于－20℃。

1.3.3 引物設(shè)計和 PCR擴(kuò)增

根據(jù) GeneBank發(fā)表的 GDF－9(登錄號 NC_000077.6)和 BMP－15(登錄號 NC_000086.7)基因的兩個外顯子的序列設(shè)計引物，引物序列及條件退火溫度見表1。PCR反應(yīng)總體積 25μL，其中 DNA為1μL(約 30ng)，上下游引物終濃度為 200ng/μL，dNTPs為 0.5μL(終濃度為 200nM/μL)，20mM Tris－HCl，pH8.3，20mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，Taq DNA聚合酶 2.5U。反應(yīng)條件:97℃預(yù)變性 5min，95℃ 變性 30s，65℃ 或者 63℃ 退火 30s，72℃延伸50s，35個循環(huán);最后再 72℃延伸 5min，4℃保存。產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.4 PCR產(chǎn)物直接測序和分析

PCR產(chǎn)物測序使用的是ABI3730平臺正向或反向測序，測序結(jié)果使用 DNAstar和 Chromas軟件分析。

1.3.5 不同基因型的 GDF－9二級結(jié)構(gòu)分析

對存在基因序列位點改變，分別使用 UCL和RNAfold軟件預(yù)測位點變化分別對編碼區(qū)和非編碼區(qū)的二級結(jié)構(gòu)的影響。

表1 擴(kuò)增基因BMP－15和GDF－9外顯子的引物Tab.1 Oligonucleotide primers for the amplification of the exons of the BMP－15 and GDF－9 exons

1.3.6 GDF－9雙熒光素酶報告基因表達(dá)載體的構(gòu)建

分別以ICR和BALB/c小鼠的全血基因組DNA為模板，擴(kuò)增目的DNA片段，引物序列如下:

KpnI－F:5'GGGGTACCATGTACAGCTAGGCATG CTTGA 3';

XhoI－R:5'CCCTCGAGTTTCACTGGCTCCACT CTGGGATT 3'。PCR產(chǎn)物用內(nèi)切酶 KpnI、XhoI進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物用天根凝膠回收試劑盒回收，回收的目的片段用 T4連接酶連接到 pGL3－Basic載體上，25℃反應(yīng)15 min，構(gòu)建重組質(zhì)粒;并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α菌株。酶切鑒定后測序驗證。分別取100 μL測序驗證正確的重組質(zhì)粒加入到50 mL的LB培養(yǎng)基中，37℃、250 r/min轉(zhuǎn)恒溫晃動培養(yǎng)過夜，然后分別提取質(zhì)粒DNA。

1.3.7 細(xì)胞的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

將293T細(xì)胞接種到48孔板進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞的密度達(dá)到90%時，使用1.3.6中提取的質(zhì)粒，按照載體pGL3與pRL－TK載體6∶1的比例進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，脂質(zhì)體2000作為轉(zhuǎn)染試劑使用脂質(zhì)體2000進(jìn)行共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。每組做3個復(fù)孔，實驗平行重復(fù)3次。

1.3.8 雙熒光素酶活性檢測

轉(zhuǎn)染48h后用雙熒光素酶檢測試劑盒進(jìn)行檢測:棄去孔內(nèi)的培養(yǎng)基，用PBS洗一遍，然后每孔加入65μL的細(xì)胞裂解液，室溫緩慢震蕩15 min;加入30μLLARⅡ，檢測螢火蟲熒光素酶活性;再加入30 μL終止反應(yīng)液，檢測海腎熒光素酶活性。每種基因型一次做3個重復(fù)孔，結(jié)果表示為相對的熒光素酶活性(螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性)。實驗平行重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 小鼠繁殖5胎的統(tǒng)計學(xué)分析

兩種品系小鼠分別記錄5胎繁殖記錄，期間死亡的小鼠按數(shù)據(jù)缺失計;數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示;組間 t檢驗，p≤0.05為差異有顯著性;使用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果見表2。

表2 表2小鼠繁殖的記錄ˉ±s)Tab.2 The mice breeding of record

表2 表2小鼠繁殖的記錄ˉ±s)Tab.2 The mice breeding of record

注:對檢測指標(biāo)進(jìn)行同列比較，A表示兩組之間差異極顯著(P＜0.01)，a表示兩組之間差異顯著(P＜0.05).Note:Detect indicators of the same column，A represents the two groups was highly significant(P ＜ 0.01)，the a said between the two groups was significantly different(P ＜0.05)

胎間隔時間(天)a Tire interval ICR 20 5 100 14.25 ± 3.866 12.85 ±4.235 26.68 ± 8.186 BALB/c 20 5 100 5.01 ±2.556 3.80 ±3.012 31.06 ±1組別Group親代數(shù)(對)Numbers of P胎數(shù)(胎)Tires樣本量(例)Samples產(chǎn)仔數(shù)(只)A Litter size離乳數(shù)(只)A Weanling number 3.010

2.2 小鼠全血基因組DNA電泳圖

注:泳道1為Marker2000，泳道2、3為 ICR品系;泳道4、5為 BALB/c品系。圖1 小鼠基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果Note:Lane 1:D2000Marker;Lanes 2、3:ICR strain;Lanes4、5:BALB/c strain.Fig.1 Electrophoretic pattern of Mouse genome DNA

2.3 PCR產(chǎn)物測序結(jié)果

GDF－9在同一品系之間測序結(jié)果沒有變化，但在不同品系之間堿基存在差別，在外顯子1的上游非編碼區(qū)的第8個堿基處，ICR為 T，BALB/c為 C(圖 2－A、a，彩插 1);外顯子 2 的 490 位 ICR 為 C，BALB/c 為 T(圖 2－B、b，彩插 1)，這不引起氨基酸的變化;746 位 ICR 為 T，BALB/c為 C(圖 2－C、c，彩插1)，該點在ICR為甲硫氨酸，在BALB/C為蘇氨酸。其中甲硫氨酸和蘇氨酸均為極性中性氨基酸，甲硫氨酸是含硫必需氨基酸，為含硫 α－氨基酸之一，是哺乳動物的必需氨基酸和生酮氨基酸。其側(cè)鏈易氧化成甲硫氨(亞)砜，在α螺旋結(jié)構(gòu)中更常見。蘇氨酸含有一個醇式羥基的脂肪族α氨基酸，L－蘇氨酸是組成蛋白質(zhì)的20種氨基酸中的一種，有兩個不對稱碳原子，可以有4種異構(gòu)體，是哺乳動物的必需氨基酸和生酮氨基酸。BMP－15不論是同一品系還是不同品系、組內(nèi)或者組間，序列均沒有的變化。

注： 圖 A、B、C 代表 ICR 品系，圖 a、b、c代表 BALB/c品系圖2 GDF-9外顯子測序結(jié)果Note: Figure A, B, C, representative of ICR strain, Figure a, b, and c represent the BALB / c strainFig.2 GDF-9 exon sequencing results

2.4 GDF9二級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析

為了驗證序列變化對非編碼區(qū)和編碼區(qū)二級結(jié)構(gòu)的影響，我們分別使用RNAfold和UCL在線預(yù)測不同基因型的 GDF－9的二級結(jié)構(gòu)。非編區(qū)位點變化沒有引起GDF－9二級結(jié)構(gòu)的變化，但對于其結(jié)構(gòu)能量熵有一定的影響，由此可知，該位點變化時對其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性有一定的影響。編碼區(qū)氨基酸的變化對其二級結(jié)構(gòu)的影響較小，為只有ICR的α螺旋結(jié)構(gòu)比BALB/c稍長(見圖3、4)。

圖3 GDF－9外顯子1上游第8位堿基變化對非編碼區(qū)二級結(jié)構(gòu)的影響Fig.3 The eighth base change of the GDF－9 exon 1 impact on non－coding region secondary structure influence

注:左邊為ICR品系，右邊為BALB/c品系。圖4 GDF－9外顯子2序列變化對蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響Note:The left is ICR strain，and the right is BALB/c strain.Fig.4 GDF－9 exon 2 sequence change on the influence of protein secondary structure

2.5 載體構(gòu)建示意圖

我們將有變化的5’UTR連接到 pGL3－Basic載體上，由于Basic載體上沒有啟動子，所以若該區(qū)域具有啟動子的功能則下游螢火蟲基因就會表達(dá)，構(gòu)建的載體示意圖見圖5。

2.6 雙熒光素酶相對活性檢測結(jié)果:

由雙熒光素酶活性可以看出，BALB/c品系中GDF－9上調(diào)下游螢火蟲熒光素酶基因的表達(dá)能力比ICR 低 38.4% 左右，P ＜ 0.05(P=0.001)具有統(tǒng)計學(xué)差異?？梢钥闯?GDF－9通過非編區(qū)影響 GDF－9基因的表達(dá)從而對于小鼠的繁殖能力是有一定的作用。

圖5 載體結(jié)構(gòu)示意圖Fig.5 Carrier structure diagram

圖6 雙熒光素酶相對活性檢測Fig.6 Dual luciferaserelative activitydetection

3 討論

3.1 ICR和BALB/c小鼠繁殖能力的比較

本研究之所以選擇一個近交系和一個遠(yuǎn)交系品種，是考慮到這兩個品系之間在產(chǎn)仔數(shù)目上存在明顯的差別，我們目的就是要研究除了自身品系之間的差別外，在基因水平是否存在能夠區(qū)分不同繁殖能力的標(biāo)記性的SNP位點。對不同品系的小鼠產(chǎn)仔能力進(jìn)行了比較，與孟瓊等［7］人研究相比，ICR產(chǎn)仔數(shù)目較以往有所提高，ICR產(chǎn)仔數(shù)目是BALB/c的2.8倍左右。

3.2 GDF-9基因的多態(tài)性

與以往的研究相比，本研究是第一次發(fā)現(xiàn)了ICR和BALB/c小鼠在 GDF－9中的5’UTR和編碼蛋白成熟區(qū)存在多態(tài)性位點，5’UTR ICR－T對下游基因的表達(dá)起調(diào)節(jié)作用。在兩種品系小鼠 GDF－9中發(fā)現(xiàn)了三個基因多態(tài)性位點，一個位于5’端非編碼區(qū) ICR到 BALB/c的堿基變化(T→C)，;另外兩個位于成熟的蛋白編碼區(qū)，其中一個引起了氨基酸的變化，另一個是無義變化。但單獨在兩種品系中均沒有檢測到SNP位點。

另外，本研究測序所得的ICR品系小鼠的GDF－9基因第一個外顯子和第二個外顯子與Gene Bank所公布的C57小鼠的基因序列同樣也存在3個堿基的不同，這種差異可能是由于小鼠品系不同造成的。

3.3 GDF-9的不同基因型的二級結(jié)構(gòu)變化

本研究運用分子生物學(xué)知識預(yù)測了不同基因型的GDF－9的二級結(jié)構(gòu)。對于研究 GDF－9在繁殖中的作用開辟了新途徑，即除了編碼區(qū)的作用之外，非編碼區(qū)的不同也對基因的功能起一定的調(diào)控作用。

3.4 GDF-9和BMP-15基因與繁殖力的關(guān)系

GDF－9是通過旁分泌方式對卵泡的生長和分化起重要作用［8］。在小鼠中，除原始卵泡以外的各個時期卵泡的卵母細(xì)胞中，GDF－9 mRNA及蛋白持續(xù)表達(dá)至排卵后，于受精后1.5天消失。利用重組GDF－9蛋白在體外研究證實:GDF－9在卵泡生長和發(fā)育的各個階段均有生物學(xué)活性并重要作用。

GDF－9在卵泡發(fā)育早期階段的重要性在一些哺乳動物中已有得到證實，例如 GDF－9缺陷小鼠［2］、母羊的自發(fā)純合突變［4］或免疫接種抵御 GDF－9［9］都表現(xiàn)出阻滯卵泡處于早期階段。McIntosh等通過主動免疫小鼠－為 GDF－9和 BMP－15的前體蛋白對卵母細(xì)胞從卵巢分泌出后起重要的監(jiān)管作用提供了生理學(xué)上的證據(jù)，包括控制排卵率和產(chǎn)仔數(shù)目［10］。在體實驗表明 GDF－9也會造成原始卵泡數(shù)量的減少［11］，體外暴露嚙齒類動物［12］和人類［13］的卵巢組織促進(jìn)了初級卵泡的進(jìn)程。

我們的研究得到 GDF－9在不同繁殖力的小鼠中，高繁殖力的ICR品系中基因型不同的5’UTR比BALB/c可以更有效的促進(jìn) GDF－9的表達(dá)，通過雙熒光素酶報告分析可以給我們以下的指示:產(chǎn)仔能力的大小可能與 GDF－9的表達(dá)量之間存在劑量依賴作用。這一點AlonKedem等的研究發(fā)現(xiàn)，從女性得到的初級卵母細(xì)胞對于重組的GDF－9和BMP－15存在劑量依賴的方式，將分離的卵母細(xì)胞暴露在這兩種生長因子中可以增加發(fā)育中的卵母細(xì)胞的數(shù)量［14］。同時 Janet和 Kenneth 研究發(fā)現(xiàn) GDF－9 和BMP－15的表達(dá)水平比例在每個物種都不相同，這點也支持了GDF－9和BMP－15的mRNA水平的不同是調(diào)控排卵率表型的關(guān)鍵因素［15］。

3.5 造成BALB/c繁殖能力降低的原因

目前，對于小鼠生殖力研究大多是在生理機制方面展開的，從現(xiàn)有文獻(xiàn)中還沒有看到與基因多態(tài)性相關(guān)的報道，本研究證明了在ICR和 BALB/c小鼠中GDF－9存在基因多態(tài)性位點，該位點與小鼠的繁殖力有密切的關(guān)系。影響小鼠繁殖力的因素包括遺傳、環(huán)境、營養(yǎng)、管理和疾病等五大因素。然而，在小鼠被生物凈化并在標(biāo)準(zhǔn)化的飼養(yǎng)環(huán)境條件下，環(huán)境、營養(yǎng)、管理和疾病等因素被嚴(yán)格地控制，而遺傳特性則成為影響小鼠繁殖力最本質(zhì)和內(nèi)在的重要因素［16］。

其中，近交衰退是影響B(tài)ALB/c繁殖能力低下的一個主要原因。從遺傳學(xué)角度來看主要可以從以下兩方面進(jìn)行解釋:1.有害的隱性基因的暴露。一般病態(tài)的突變基因絕大多數(shù)都是隱性的，所以處于雜合狀態(tài)時不表現(xiàn)出病態(tài)或不利的性狀。這些有害基因的作用可被顯性的雜合子等位基因所掩蓋，但經(jīng)過一段近親繁殖，純合的基因(純合子)比例漸漸增多，于是有害的隱性基因相遇成為純合子而顯出作用，出現(xiàn)不利性狀，對個體的生長發(fā)育、生活和生育等產(chǎn)生明顯的不利影響。2.多基因平衡的破壞。個體的發(fā)育受多個基因共同作用的影響，雖然其中每個基因的作用效應(yīng)微小。對環(huán)境適應(yīng)較好的野生或雜交動物，由于自然選擇的作用有利于保存那些生物適應(yīng)能力較強的基因組合具有平衡的多基因系統(tǒng)，近交繁殖往往會破壞這個平衡，造成個體發(fā)育的不穩(wěn)定［17］。

目前在環(huán)境毒理和人類避孕方面的研究中需要高繁殖力的小鼠，若能找出繁殖力與基因之間的關(guān)系，就可以利用提前篩選性培育技術(shù)來提高小鼠的生產(chǎn)繁殖效率，提高實驗動物的經(jīng)濟(jì)效益，也可以為篩選相關(guān)的模型動物種群提供幫助。本研究發(fā)現(xiàn)了GDF－9在繁殖能力不同的品系小鼠 ICR和BALB/c中的多態(tài)性，為篩選相關(guān)的模型動物種群提供參考資料。

［1］Otsuka F，McTavish KJ，Shimasaki S.Integral role of GDF－9 and BMP－15 in ovarian function［J］.MolReprod Dev2011，78:9－21.

［2］Dong J， AlbertiniD F， NishimoriK， etal.Growth differentiation factor－9 is required during early ovarian folliculogenesis［J］.Nature，1996，383，531 －535.

［3］Galloway SM，McNatty KP，Cambridge LM，et al.Mutations in an oocyte－derived growth factorgene(BMP － 15)cause increased ovulation rate and infertility in a dosage－sensitive manner［J］.Nat.Genet，25，279 － 283.

［4］Hanrahan J.P.，Gregan S.M.，Mulsant，et al.Mutations in the genes for oocyte－derived growth factors GDF－9 and BMP－15 are associated with both increased ovulation rate and sterility in Cambridge and Belclare sheep(Ovisaries)［J］.Biol.Reprod，70，900 －909.

［5］http://www.informatics.jax.org/.

［6］Bodensteiner K J，Clay C M，Moeller C L，et al.Molecular cloning of the ovineGrowth/Differentiation factor－9 gene and expression of growth/differentiation factor－9 in ovine and bovine ovaries［J］.Biol Report，1999，60(2):381 － 386.

［7］Kaivo－Oja N， Bondestam J， K?m?r?inen M， et al.Growth differentiation factor－9 induces Smad2 activation and inhibin B production in cultured human granulosa－luteal cells ［J］.J ClinEndocrinolMetab，2003，88(2):755 － 762.

［8］孟瓊，楊錫平，胡一江，等.3個不同品種小鼠繁殖性能及生長發(fā)育的比較觀察［J］。湖南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2000，20(03):9－10.

［9］Juengel JL，Hudson NL，Berg M，et al.Effects of active immunization against growth differentiation factor 9 and/or bone morphogenetic protein 15 on ovarian function in cattle［J］.Reproduction，2009，138(1):107 －114.

［10］C Joy McIntosh，Steve Lawrence，Peter Smith，et al.Active immunization against the proregions of GDF－9 or BMP15 alters ovulation rate and litter size in mice［J］.Reproduction，2012 Feb，143(2):195 －201.

［11］Vitt UA，Hayashi M，Klein C，et al.Growth differentiation factor－9 stimulates proliferation butsuppresses the folliclesti mulating hormone－induced differentiation of cultured granulosa cells from small antral and preovulatory ratfollicles［J］.BiolReprod，2000a，62(2):370 －377.

［12］Hayashi M，McGee EA，Min G，et al.Recombinant growth differentiation factor－9 (GDF－9) enhances growth and differentiation of cultured early ovarian follicles［J］.Endocrinology，1999，140(3):1236－1244.

［13］Nilsson EE，Skinner MK.Growth and Differentiation Factor－9 Stimulates Progression of Early Primary but Not Primordial Rat Ovarian Follicle Development［J］.Biology of Reproduction，2002，67:1018 －1024.

［14］AlonKedem， Benjamin Fisch， RoniGaror， etal.Growth Differentiating Factor 9 (GDF－9)and Bone Morphogenetic Protein 15 both Activate Development of Human Primordial Follicles in Vitro，with Seemingly More Beneficial Effects of GDF－9［J］.J Clin Endocrinol MeTab，2011，96(8):E1246 －1254.

［15］Janet L.Crawford，Kenneth P.McNatty.The ratio of growth differentiation factor 9:Bone morphogenetic protein 15 mRNA expression is tightly co－regulated and differs between species over a wide range of ovulation rates［J］.Molecular and Cellular Endocrinology.348(2012)339– 343.

［16］孫德明，李根平等.《實驗動物從業(yè)人員上崗培訓(xùn)教材》［M］.北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2011:3－4.

［17］Charles worth D，Willis JH.The genetics of inbreeding depression［J］.Nature reviews Genetics.Nov，2009，10(11):783 －796.