劉 薇，史俊文，岳 敏，張婷婷，唐 華，袁 進(jìn)，肖 東，顧為望

(1.南方醫(yī)科大學(xué) 比較醫(yī)學(xué)研究所暨實驗動物中心，2.腫瘤研究所，廣州 510515)

豬在解剖、生理、生化代謝等方面與人類十分相似，近年來將豬用作醫(yī)學(xué)實驗動物呈越來越普遍的趨勢［1］。軟骨細(xì)胞是一種高分化的細(xì)胞，人體關(guān)節(jié)損傷之后，關(guān)節(jié)軟骨在體內(nèi)不能增殖修復(fù)受損關(guān)節(jié)，用組織工程的方法制作人工關(guān)節(jié)為臨床上治療關(guān)節(jié)損傷提供了一種可能的方法，可以通過將軟骨細(xì)胞種植在特殊材料的支架上，構(gòu)建人工組織，來修復(fù)受損關(guān)節(jié)［2，3］。小型豬體型適中，價格經(jīng)濟(jì)，獲得容易，是進(jìn)行關(guān)節(jié)軟骨損傷的良好實驗材料［4］。西藏小型豬是由南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心顧為望教授等人于2004年由西藏自治區(qū)引種至廣州培育而成的小型豬品系，在近幾年，已基于其建立了幾種轉(zhuǎn)基因動物模型［5，6］。本研究擬分離培養(yǎng)西藏小型豬肋軟骨細(xì)胞，并對其進(jìn)行鑒定，為后續(xù)的軟骨組織工程研究提供必備的實驗材料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗動物

西藏小型豬:3日齡普通級雄性西藏小型豬1頭，南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供【SCXK粵2011-0015】。

小鼠:8周齡BALB/c小鼠一只，南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供【SCXK粵2011-0015】。

1.1.2 主要試劑及耗材

胎牛血清、高糖DMEM培養(yǎng)基、非必需氨基酸、L-谷氨酰胺購自 Hyclone公司。青霉素-鏈霉素溶液、胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶、DMSO等購自 Invitrogen公司。DAPI、甲苯胺藍(lán)染料購自sigma公司。兔抗人Aggrecan一抗購自SANTA公司，鼠抗人CollagenⅡ一抗購自Invitrogen公司，羊抗兔和羊抗鼠Alexa Fluor 555紅色熒光標(biāo)記二抗購自 Invitrogen公司。培養(yǎng)瓶及培養(yǎng)板等購自Corning公司。其余試劑為國產(chǎn)或進(jìn)口化學(xué)純或分析純。

軟骨細(xì)胞完全培養(yǎng)基配方:DMEM培養(yǎng)基，加入10%胎牛血清、維生素 C(終濃度為50 μg/mL)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

西藏小型豬肋軟骨細(xì)胞(PCCs)分離培養(yǎng):將3日齡西藏小型豬過量麻醉，處死，腹部皮膚剃毛，碘酊、75%酒精消毒，剪開腹部皮膚，無菌剪取肋軟骨一段，置于裝有含雙抗的 PBS的10 mm平皿中，運(yùn)回超凈臺進(jìn)行后續(xù)操作。將取下的肋軟骨用含雙抗的PBS洗兩遍，分離表面附著的軟骨膜、肌肉等組織，將分離好的肋軟骨剪成0.1 mm3的小碎塊，收集到15 mL離心管中，加入0.1% Ⅱ型膠原酶2 mL，消化30 min，PBS洗兩遍，然后加入新鮮 0.1%Ⅱ型膠原酶5 mL，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)消化5 h，每1小時吹打一次，觀察大部分軟骨塊消化后，加入完全培養(yǎng)基終止消化，200 g，4℃離心10 min，棄上清，加入完全培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)入25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)(培養(yǎng)條件:37℃、5%CO2、飽和濕度)。當(dāng)原代細(xì)胞生長達(dá)80%～90%融合時，進(jìn)行傳代。先吸除舊培養(yǎng)液，PBS洗滌 2遍，棄 PBS并加入0.25%胰酶進(jìn)行消化，37℃培養(yǎng)箱中消化約5 min，鏡下觀察細(xì)胞消化情況，當(dāng)大多數(shù)細(xì)胞變圓，立即加入2 mL完全培養(yǎng)基終止消化，然后仔細(xì)吹打細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液收集至15mL離心管中，200 g，4℃離心10 min。棄上清液后，再用完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，并輕輕吹打使細(xì)胞分散均勻，傳入新的培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)。

小鼠肋軟骨細(xì)胞(MCCs)分離培養(yǎng):取8周齡BALB/c小鼠一只，參照以上西藏小型豬肋軟骨細(xì)胞分離培養(yǎng)的方法分離培養(yǎng)其肋軟骨細(xì)胞。

西藏小型豬胚胎成纖維細(xì)胞(PEFs)和小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEFs)的培養(yǎng):使用本實驗室凍存的PEFs［7］和 MEFs，復(fù)蘇，傳代至 P5，備用。

1.2.2 西藏小型豬肋軟骨細(xì)胞的鑒定

甲苯胺藍(lán)染色是軟骨細(xì)胞的特異性染色，原理是軟骨細(xì)胞分泌的蛋白聚糖經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色顯色為異染的藍(lán)紫色。軟骨細(xì)胞特異性分泌蛋白聚糖(Aggrecan)和Ⅱ型膠原蛋白(CollagenⅡ)，通過對兩種蛋白的檢測陽性可證明所分離培養(yǎng)的細(xì)胞是軟骨細(xì)胞［8］。本實驗分別以 PEFs和 MEFs為陰性對照，對所分離培養(yǎng)的PCCs和MCCs進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色鑒定以及蛋白聚糖和Ⅱ型膠原的免疫熒光染色鑒定，如果待鑒定的PCCs和MCCs為甲苯胺藍(lán)陽性及蛋白聚糖和Ⅱ型膠原的免疫熒光陽性，即可證明所分離培養(yǎng)的PCCs為軟骨細(xì)胞。

甲苯胺藍(lán)染色:0.5 g甲苯胺藍(lán)溶于100 mL PBS中配成0.5%甲苯胺藍(lán)染液，將以上四種細(xì)胞傳代至3.5 cm平皿中，PCCs和 MCCs均為 P1代，PEFs和MEFs為P5代，四種細(xì)胞分別用4%多聚甲醛固定10 min，PBS洗三次，甲苯胺藍(lán)染色30 min，光鏡下觀察拍照。

取西藏小型豬膝關(guān)節(jié)處5 mm×5 mm×5 mm軟骨組織 (用作細(xì)胞染色的陽性對照)，按照常規(guī)步驟進(jìn)行固定、脫水、石蠟切片的制作。將石蠟切片脫蠟去水，用以上甲苯胺藍(lán)染色液染色30 min，95%酒精分化5 s，浸入二甲苯5 min，中性樹膠封片。

蛋白聚糖和Ⅱ型膠原的免疫熒光檢測:在六孔板內(nèi)鋪蓋玻片，四種細(xì)胞分別各接種兩個孔，制作細(xì)胞爬片，待細(xì)胞密度達(dá)到70% ～80%時，PBS洗三次，用4%多聚甲醛將細(xì)胞固定10 min，PBS洗三次，0.5%Triton-100透化 10 min，PBS洗三次，山羊血清封閉20min(常溫)，加入KB稀釋的一抗(稀釋倍數(shù):Aggrecan和 CollagenⅡ均為 1∶200)，37℃孵育2 h，PBS洗三次，加入 KB稀釋的紅光二抗(80μl/片)，37℃避光孵育 1 h，PBS 洗三次，避光加DAPI(0.2 mg/μL)10 μL 于載玻片上，加入等量的防熒光淬滅封片劑，蓋上蓋玻片(細(xì)胞面朝下)，指甲油封片，正置熒光顯微鏡下觀察。

抗體稀釋液KB十倍儲存液的配制方法:Tris 1.21 g;NaCl 8.8 g;BSA 3 g溶于100 mL ddH2O中。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)

原代培養(yǎng)24 h后，可見西藏小型豬肋軟骨細(xì)胞開始貼壁生長，細(xì)胞形態(tài)呈三角形、梭形、成纖維狀，細(xì)胞核為圓形或橢圓形，位于胞體中心，細(xì)胞在培養(yǎng)3天后，融合度達(dá)到90%左右。而同期培養(yǎng)的小鼠肋軟骨細(xì)胞，則呈現(xiàn)圓形和多角形兩種形態(tài)，其中圓形細(xì)胞占大多數(shù)，且細(xì)胞長滿后排列緊密，呈現(xiàn)典型的“鋪路石”狀。PCCs雖然為成纖維細(xì)胞狀，但是與典型的成纖維細(xì)胞PEFs相比，PCCs的細(xì)胞大小要小很多，因此它并不同于成纖維細(xì)胞(圖1，封二)。

注：PEFs:西藏小型豬胚胎成纖維細(xì)胞；PCCs: 西藏小型豬肋軟骨細(xì)胞；MCCs:小鼠肋軟骨細(xì)胞；MEFs：小鼠胚胎成纖維細(xì)胞圖1 西藏小型豬肋軟骨細(xì)胞的原代培養(yǎng)Note: PEFs: pig embryonic fibroblasts; PCCs: pig rib chondrocytes; MCCs: mouse rib chondrocytes;MEFs: mouse embryonic fibroblastsFig.1 Primary culture of rib chondrocytes of the tibetan miniature pig

2.2 甲苯胺藍(lán)染色

經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色可見，西藏小型豬關(guān)節(jié)軟骨組織甲苯胺藍(lán)染色陽性，軟骨基質(zhì)為異染的藍(lán)紫色，切片上可見處于不同成熟階段的軟骨細(xì)胞，而所分離培養(yǎng)的PCCs和MCCs均呈甲苯胺藍(lán)染色陽性，軟骨細(xì)胞內(nèi)可見藍(lán)紫色異染顆粒(圖2，封二)。

注: A: PEFs; B: PCCs; C: MEFs; D: MCCs; E: 西藏小型豬關(guān)節(jié)軟骨組織切片圖2 西藏小型豬肋軟骨細(xì)胞甲苯胺藍(lán)染色Note: A: PEFs; B: PCCs; C: MEFs; D: MCCs; E: histological sections of articular cartilage of Tibetan miniature pigsFig.2 Toluidine blue staining of tibetan miniature pigs rib chondrocytes

2.3 蛋白聚糖和Ⅱ型膠原的免疫熒光

經(jīng)免疫熒光檢測，PCCs和MCCs均呈蛋白聚糖和Ⅱ型膠原陽性(圖3，見彩插1)。

注：藍(lán)色示DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核；紅色示蛋白聚糖和II型膠原；PEFs:西藏小型豬胚胎成纖維細(xì)胞；PCCs: 西藏小型豬肋軟骨細(xì)胞；MCCs:小鼠肋軟骨細(xì)胞，MEFs：小鼠胚胎成纖維細(xì)胞圖3 西藏小型豬肋軟骨細(xì)胞免疫熒光染色Note: blue: nucleus marked by DAPI; red: Aggrecan and Collagen II; PEFs: pig embryonic fibroblasts;PCCs: pig rib chondrocytes; MCCs: mouse rib chondrocytes; MEFs: mouse embryonic fibroblastsFig.3 Immunofluorescence stain of tibetan miniature pigs rib chondrocytes

3 討論

軟骨主要由軟骨細(xì)胞和軟骨基質(zhì)組成，采用膠原酶消化的方法就可以獲得種類單一的軟骨細(xì)胞。軟骨基質(zhì)主要包括膠原和蛋白聚糖，其中Ⅱ型膠原占膠原的95%，軟骨細(xì)胞分泌的蛋白聚糖可以通過甲苯胺藍(lán)染色顯色為異染的藍(lán)紫色，因此，可以采用甲苯胺藍(lán)染色法對所分離培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞進(jìn)行鑒定，同時用Ⅱ型膠原和蛋白聚糖的免疫熒光也可以對軟骨細(xì)胞進(jìn)行鑒定。

本實驗采用二步消化法成功分離培養(yǎng)獲得西藏小型豬肋軟骨細(xì)胞，所培養(yǎng)的原代西藏小型豬肋軟骨細(xì)胞呈三角形、梭形及成纖維狀。而典型的大小鼠和兔的軟骨細(xì)胞均是圓形與多角形的，細(xì)胞密集時會呈現(xiàn)“鋪路石”狀［8，9，10］，本實驗同期培養(yǎng)的小鼠原代肋軟骨細(xì)胞也呈現(xiàn)圓形和多角形，與文獻(xiàn)一致。經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色以及蛋白聚糖和Ⅱ型膠原免疫熒光反應(yīng)，均證實所分離培養(yǎng)的PCCs為軟骨細(xì)胞。因此，西藏小型豬的肋軟骨細(xì)胞的特殊形態(tài)，可能與豬這個物種有關(guān)。PCCs的成纖維狀與典型的成纖維細(xì)胞并不相同，由圖1可以看出，與PEFs相比，PCCs要小很多，說明兩者有很大的形態(tài)差異。

本實驗成功分離了西藏小型豬的肋軟骨細(xì)胞，這為進(jìn)一步用西藏小型豬進(jìn)行軟骨損傷修復(fù)的研究提供了良好的實驗材料。

(本文圖1，2見封二，圖3見彩插1。)

圖1 野生型實驗組小鼠肝組織Fig.1 Liver biopsy of Wild-type experimental group mouse

圖2 野生型對照組小鼠肝組織Fig.2 Liver biopsy of Wild-type control group mouse

圖3 野生型實驗組小鼠肝組織切片（HE）Fig.3 Liver biopsy of Wild-type experimental group mouse(HE)

圖4 敲基因型實驗組小鼠肝組織切片（HE）Fig.4 Liver biopsy of Knock genotype experimental group mice(HE)

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