隋麗華，劉 一，趙彥斌，張小飛，崔曉霞，葉華虎，白杰英，許 琴，孫兆增，曾 林

(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，北京 100071)

獼猴B病毒(Macaque B virus)又獼猴皰疹病毒，是人獸共患病病毒。B病毒在猴體內(nèi)的存在比率隨著年齡的增加，陽性率越來越高，在有些飼養(yǎng)場的老年猴群中陽性率在90%左右。B病毒陽性的獼猴，終生攜帶病原，傳染性較強(qiáng)，不僅嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，造成人力物力的極大浪費(fèi)，而且飼養(yǎng)人員與實(shí)驗(yàn)人員感染后死亡率及高，幸存者也會(huì)留下神經(jīng)后遺癥［3－8，12－14］。因此，及時(shí)、準(zhǔn)確的檢測出 B病毒，并控制其傳播，對(duì)于獼猴的生產(chǎn)和人獸共患病的防控，具有重要意義［11］。

B病毒為Ⅳ級(jí)生物安全防護(hù)病原，因此在研制獼猴B病毒的檢測試劑時(shí)，用全病毒做抗原檢測抗體需在3級(jí)以上實(shí)驗(yàn)室完成，危險(xiǎn)性高、分離培養(yǎng)耗時(shí)長，局限性大［4］。而它與人的單純皰疹病毒1型(human simple herpes virus-1，HSV-1)和人的單純皰疹病毒2型(human simple herpes virus-1，HSV-2)病毒具有較強(qiáng)的抗原交叉性，目前多用人單純皰疹病毒做抗原替代獼猴B病毒，但作為診斷試劑，要求靈敏度高、特異性強(qiáng)，才能更好地區(qū)別 B 病毒與其它皰疹病毒［1，2，10］。目前，用于B病毒檢測的重組抗原主要是其囊膜蛋白gB、gC和gD，gC蛋白作為重組抗原特異性最高，但檢出率低于gB，gD的檢出率和特異性都較差，gB重組蛋白作為抗原，檢出率最高，但作為囊膜蛋白，其抗原性強(qiáng)，分子量巨大，可溶性抗原生產(chǎn)困難。本研究利用B病毒高度保守的gB基因，通過構(gòu)建B病毒gB基因原核表達(dá)載體，并利用原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)，期望獲得靈敏性和特異性較好的重組蛋白，為獼猴B病毒檢測試劑盒的研制奠定基礎(chǔ)［8，9，15］。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

高純質(zhì)粒小量快速提取試劑盒、凝膠回收試劑盒、T4 連接酶、E.coli DH5a、BL21(DE3)pLysS 菌株購自北京博邁德生物公司;2×Taq PCR Master Mix購自上海捷瑞生物工程有限公司;Bam HⅠ和XhoⅠ內(nèi)切酶、pMD 18-T Vector載體均為大連寶生物公司產(chǎn)品;IPTG為sigma公司產(chǎn)品。

1.2 引物設(shè)計(jì)

為了將gB基因片段定向連接pET-22b載體，根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫上gB基因序列和載體的特異性位點(diǎn)，設(shè)計(jì)1對(duì)引物，上游引物:5＇-cgc gga tcc gca cag ctg gcc ctg gat gaa-3＇，下游引物:5＇-ccg ctc gag ttc ttc tgg tgc aac aac-3＇。

1.3 基因合成

從GenBank上獲得B病毒的 gB蛋白序列，并將其與人的單純皰疹病毒、帶狀皰疹病毒等的 gB蛋白序列進(jìn)行比較。選擇 gB蛋白序列中，抗原表位強(qiáng)，但與其它皰疹蛋白同源性較低的序列，進(jìn)行合成，合成序列的總長度為597 bp，基因片段的兩端酶切位點(diǎn)為EcolⅠ和NdeⅠ。基因片段由上海捷瑞生物工程有限公司合成，命名為gB合。

1.4 pET-22b載體的構(gòu)建

利用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引入Bam HⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)。將回收后的gB基因片段連接到pMD 18-T Vector載體。將連接后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞，利用PCR方法篩選出陽性質(zhì)粒pMD18-T Vector-gB合;將此陽性質(zhì)粒用 Bam HⅠ和XhoⅠ進(jìn)行酶切，回收后的片段連接到 pET-22b載體上，轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)pLysS感受態(tài)細(xì)胞。

1.5 合成基因的誘導(dǎo)表達(dá)

將pET-22b-gB轉(zhuǎn)化BL21(DE3)pLysS感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落在含氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)至OD值為0.6，加入終濃度為0.3 mM的IPTG，室溫誘導(dǎo)4 h。取50 μL誘導(dǎo)后的菌液與等體積的2×上樣緩沖液混合，煮沸5 min。樣品上樣量為20 μL，利用10%的SDS-PAGE電泳，檢測蛋白的表達(dá)情況。

1.6 重組蛋白的純化

1L LB液體培養(yǎng)基中按1%接種過夜培養(yǎng)菌，37℃，220 rpm培養(yǎng) 3.5 h，加入 IPTG的終濃度至0.3 mM，室溫27.3℃誘導(dǎo)表達(dá)4h。離心去上清，用每克4 mL的裂解緩沖液重懸，－20℃過夜。采用鎳結(jié)合蛋白親和層析柱純化目的蛋白，用包含20 mM咪唑的沖洗緩沖液去除非特異結(jié)合的蛋白，含250 mM咪唑的洗脫緩沖液進(jìn)行洗脫，收集純化蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，樣品上樣量為15 μL，分離膠的濃度為10%。利用考馬斯亮藍(lán)進(jìn)行染色，觀察電泳結(jié)果，并照相。利用 Western-blot方法，檢測重組蛋白與B病毒陽性血清的反應(yīng)原性。

2 結(jié)果

2.1 基因合成結(jié)果分析

gB合基因重組質(zhì)粒的 PCR鑒定見圖1，擴(kuò)增得到目的片段，其大小為597bp，基因片斷與預(yù)期結(jié)果基本相符。

注:M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn);1:重組質(zhì)粒p5X-gB合的PCR結(jié)果。圖1 重組質(zhì)粒p5X-gB合PCR鑒定Note:M:DNA marker;Lane 1:The PCR results of the product of recombinant plasmid p5X-gB合.Fig.1 PCR amplification of the recombinant plasmid P5X-gB

2.2 pMD 18-T Vector-gB合載體構(gòu)建結(jié)果分析

將基因片段定向連接到pMD 18-T Vector載體。將連接后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 E.coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞，利用菌液PCR及雙酶切篩選出陽性質(zhì)粒pMD 18-T Vector-GB合，結(jié)果如圖 2。

注:A(PCR鑒定):M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn);1:重組質(zhì)粒pMD 18-T Vector-gB合PCR鑒定結(jié)果B(雙酶切鑒定):M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn);1:重組質(zhì)粒pMD 18-T Vector-gB合的BamHⅠ和XhoⅠ 雙酶切結(jié)果。圖2 重組質(zhì)粒pMD 18-T Vector-gB合PCR及雙酶切鑒定Note:A(PCR identification):M:DNA marker;Lane 1:The PCR results of the product of recombinant plasmid pMD 18-T Vector-gB合 PCR.B(Double Enzyme digestion identification):M:DNA marker;Lane 1:the productof of Enzyme digestion with BamHⅠ和 XhoⅠofrecombinant plasmid pMD 18-T Vector-gB合.Fig.2 PCR and Enzyme digestion amplification of the recombinant plasmid pMD 18-TVector-gB

2.3 pET-22b-gB合載體的構(gòu)建

用雙酶切方法將陽性基因質(zhì)粒從重組質(zhì)粒pMD 18-T Vector-gB合上分離后，膠回收鑒定，將陽性基因片段通過T4連接酶定向連接到pET-22b載體。轉(zhuǎn)化到具有表達(dá)性的BL(DE3)21感受態(tài)細(xì)胞上，經(jīng)PCR和雙酶切鑒定，成功建立pET-22b-gB重組質(zhì)粒并大量擴(kuò)增，結(jié)果如圖3。

注:A(PCR鑒定):M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn);1:重組質(zhì)粒pET-22b-gB PCR鑒定結(jié)果B(雙酶切鑒定):M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn);1:重組質(zhì)粒pET-22b-gB的BamHⅠ和XhoⅠ 雙酶切結(jié)果圖3 重組質(zhì)粒pET-22b-gB PCR及雙酶切鑒定Note:A(PCR identification):M:DNA marker;Lane 1:The PCR results of the product of recombinant plasmid pET-22b-gB PCR B(Double Enzyme digestion identification):M:DNA marker;Lane 1:the productof of Enzyme digestion with BamHⅠ和XhoⅠofrecombinant plasmid pET-22b-gB.Fig.3 PCR and Enzyme digestion amplification of the recombinant plasmid pET-22b-gB

2.4 合成基因的誘導(dǎo)表達(dá)

將pET-22b-gB合轉(zhuǎn)化BL21(DE3)pLysS感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE電泳，檢測蛋白的表達(dá)情況，如圖4，在約26×103處出現(xiàn)目的蛋白條帶，與預(yù)期重組蛋白的分子質(zhì)量吻合。

注:M:蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1:pET-22b對(duì)照;2:pET-22b-gB誘導(dǎo)表達(dá)菌。圖4 SDS-PAGE檢測重組蛋白表達(dá)Note:M:protein molecular standard;1:pET-22b plasmid control;2:Induce products of pET-22b-gB.Fig.4 Detection of recombinant protein expression by SDS-PAGE

2.5 重組蛋白的純化

重組菌誘導(dǎo)表達(dá)后，柱層析純化的蛋白經(jīng)SDSPAGE電泳，3－5為A280不同吸光度值特異性洗脫目的條帶，3、4未出現(xiàn)目的條帶，5開始出現(xiàn)目的條帶，吸光度值為79，如圖5。

2.6 重組蛋白Western blot分析

純化的目的蛋白，通過 Western-blot分析，證實(shí)重組蛋白與B病毒陽性血清具有反應(yīng)原性。如圖6。

3 討論

病毒囊膜糖蛋白在病毒入侵宿主細(xì)胞的過程中作用顯著。據(jù) Perelygina等［17］報(bào)道，用于 B病毒診斷的糖蛋白 gB、gC、gD敏感性分別為 100%、97.3%、88%。為了獲得更靈敏、特異的 B病毒檢測方法，國內(nèi)已有利用基因工程技術(shù)產(chǎn)生猴BV囊膜重組蛋白，王瓊等［8］用桿狀病毒作為表達(dá)載體表達(dá)了猴BV gB蛋白片段，段博芳等［16］用猴 B病毒gB基因在昆蟲細(xì)胞中獲得表達(dá)，肖鏡等［3］表達(dá)了猴B病毒gD蛋白片段，已證實(shí)重組蛋白具有較好的抗原性。

注:M:蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1:pET-22b質(zhì)粒對(duì)照;2:pET-22b-gB誘導(dǎo)表達(dá)菌細(xì)胞破碎產(chǎn)物;3－5:特異性洗脫蛋白。圖5 SDS-PAGE檢測重組蛋白表達(dá)、純化Note:M:protein molecular standard;Lane 1:pET-22b plasmid control;Lane 2:Induced products of pET-22b-gB;Lane 3－5:specific elution protein.Fig.5 Detection of recombinant protein expression and Purification by SDS-PAGE

注:M:蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1:pET-22b-gB Western-blot結(jié)果;2:pET-22b對(duì)照。圖6 重組蛋白Western-blot分析Note:M:protein molecular standard;Lane 1:products of Western-blot of pET-22b-Gb;Lane 2:pET-22b plasmid control.Fig.6 Western blot analysis of pET-22-gB

本試驗(yàn)選擇猴BV的gB蛋白的抗原表位強(qiáng)、且與其它皰疹病毒蛋白同源性較低的序列進(jìn)行合成，并對(duì)其密碼子進(jìn)行了優(yōu)化，采用pET-22b載體，通過原核表達(dá)系統(tǒng)，選擇適于誘導(dǎo)表達(dá)的IPTG濃度、誘導(dǎo)溫度及時(shí)間，避免產(chǎn)生包涵體，成功獲得 pET-22b-gB可溶性表達(dá)產(chǎn)物。通過鎳結(jié)合蛋白親和層析柱純化，純化過程相對(duì)簡單，具有易于大量制備的優(yōu)點(diǎn)，獲得了純度約為85%的目的蛋白，通過Western-blot證實(shí)，B病毒 gB基因重組蛋白具有較好的抗原性，為進(jìn)一步取代全病毒作為抗原的ELISA方法奠定了基礎(chǔ)。

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