彭織云，王敬敬，唐曉陽，潘迎捷，趙 勇

（上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室（上海），上海201306）

由于傳統(tǒng)的微生物計數(shù)方法費時費力，而分子生物學(xué)方法能快速直接地定量微生物的數(shù)量，所以運用分子生物學(xué)方法檢測及定量食品中微生物正逐年增加[1]。運用定量PCR方法檢測食源性致病菌的數(shù)量已經(jīng)通過ISO標(biāo)準(zhǔn)（ISO 22174：2005，ISO/TS 20836：2005，ISO 20837：2006，ISO 20838：2006）。目前，已有很多研究利用Real-time qPCR方法對食品樣品中的微生物進(jìn)行定量檢測，如Burkhard等[2]運用Real-time qPCR方法定量檢測食品中沙門氏菌，Hagi等[3]報道可以運用分子生物學(xué)方法監(jiān)測復(fù)雜環(huán)境中微生物的生長及活力。運用Real-time qPCR方法只需提取樣品DNA，進(jìn)行Real-time PCR操作即可，整個過程約5h就可得到目的菌株的數(shù)量；而傳統(tǒng)的涂布計數(shù)方法需要通過梯度稀釋，再經(jīng)過選擇性培養(yǎng)基的過夜培養(yǎng)，才能得到目的菌株的數(shù)量。而且Real-time qPCR方法可以同時檢測不同的微生物甚至是活的不可培養(yǎng)的微生物（VBNC）[4]。所以，運用Real-time qPCR方法建立微生物生長預(yù)測模型有很大的優(yōu)勢。但是，用分子生物學(xué)方法建立微生物生長預(yù)測模型還處于初期階段，在條件的摸索和模型的選擇上還需大量的基礎(chǔ)研究。本實驗就運用Real-time qPCR絕對定量方法對比涂布計數(shù)方法建立即食蝦中副溶血性弧菌生長預(yù)測模型。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

南美白對蝦 購自上海浦東新區(qū)果園農(nóng)貿(mào)市場；副溶血性弧菌 分離自臨床樣本；DNA提取試劑盒、克隆試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒 Tiangen公司；QUANT-IT PICOGREEN DSDNA試劑盒 Invitrogen公司；熒光定量試劑盒 ABI公司；TCBS培養(yǎng)基成分（g/L） 蛋白胨10.0、酵母粉5.0、氯化鈉10.0、檸檬酸鈉10.0、牛膽汁粉5.0、蔗糖20.0、檸檬酸鐵1.0、膽酸鈉3.0、硫代硫酸鈉10.0、溴麝香草酚藍(lán)0.04、麝草酚藍(lán)0.04、瓊脂15.0；3%氯化鈉堿性蛋白胨水（APW）成分（g/L） 蛋白胨10.0、氯化鈉30.0；均質(zhì)袋 北京陸橋公司。

高精度恒溫培養(yǎng)箱 日本Sanyan公司；BagMixer 400 VW型拍打式均質(zhì)器 法國Interscience公司；離心機(jī) 德國eppendorf公司；7500fast熒光定量儀 ABI公司；Biotek多功能酶標(biāo)儀 gene公司。

1.2 樣品采集和處理

用浸泡接種法將初始菌量為6lg CFU/mL副溶血性弧菌接種到煮熟的南美白對蝦（約13g）上，附著0.5h，37℃培養(yǎng)，每隔1h取3只蝦放入均質(zhì)袋中并加入100mL APW均質(zhì)2min，用生理鹽水10倍稀釋，在TCBS培養(yǎng)基上涂布并過夜培養(yǎng)。同時收集均質(zhì)液1mL，12000r/min離心2min收集菌體，-20℃保存。

1.3 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建

1.3.1 采用克隆技術(shù)構(gòu)建目的質(zhì)粒 tlh正向引物：ACTCAACACAAGAAGAGATCGACAA；tlh反向引物：GATGAGCGGTTGATGTCCAA，用克隆試劑盒克隆成功后挑取陽性克隆繼續(xù)培養(yǎng)。用質(zhì)粒試劑盒提取重組質(zhì)粒，并送測（生工公司）。

1.3.2 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品絕對定量 用1×TE溶液10倍稀釋λDNA標(biāo)準(zhǔn)品，每100μL中加入100μL PicoGreen混勻，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，用Biotek測定質(zhì)粒濃度。

1.4 DNA的提取和Real-time qPCR

按天根試劑盒說明書提取DNA。Real-time qPCR體系：2×mix（含SYBR Green）10μL、正反引物各1μL、ddH2O 8μL，DNA模板1μL。PCR擴(kuò)增程序為：50℃2min；95℃預(yù)變性10min；95℃變性15s，60℃退火1min，40個循環(huán)。

1.5 模型建立

運用Origin 8.0軟件對兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，建立Gompertz模型、Logistic模型和Richards模型。Gompertz模型的數(shù)學(xué)表達(dá)式如下：

Logistic模型的數(shù)學(xué)表達(dá)式如下：

Richards模型的數(shù)學(xué)表達(dá)式如下：

式中，N：微生物在時間t時的菌量，CFU/g；N0：t=0時微生物初始菌量，CFU/g；A：N達(dá)到最大時對應(yīng)的lnN/lnN0的值；μmax：最大生長速率，h-1；λ：延滯期。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品絕對定量

在NCBI上比對插入序列，確定引物特異性很好。絕對定量標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合公式為：Y=0.983X+2.71（R2=0.999），擬合度很好。質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度為29.8ng/μL。根據(jù)拷貝數(shù)計算公式得到質(zhì)?？截悢?shù)為10^9 copies/μL[5]。

2.2 Real-time qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

評價標(biāo)準(zhǔn)曲線的優(yōu)劣有兩個指標(biāo)，相關(guān)系數(shù)（R2）和擴(kuò)增效率（E）。Real-time標(biāo)準(zhǔn)曲線，E為92.011%，R2為0.984。相關(guān)系數(shù)反映標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線性，理想值應(yīng)大于0.98；PCR理想的擴(kuò)增效率應(yīng)在80%到120%之間，本實驗結(jié)果均符合理想值。

2.3 熟蝦中副溶血性弧菌生長模型擬合

通過Origin 8.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合。圖1為37℃條件下，即食蝦中副溶血性弧菌生長曲線的擬合。

圖1中的A、B、C圖分別是用Gompertz模型、Richard模型和Logistic模型對Real-time qPCR定量方法和傳統(tǒng)涂布計數(shù)方法所得數(shù)據(jù)建立37℃條件下副溶血性弧菌的生長預(yù)測模型。

表1 三種模型生長參數(shù)擬合結(jié)果Table 1 The result of the parameters from three models

Real-time qPCR法和涂布計數(shù)法均能用Gompertz模型、Logistic模型和Richard模型進(jìn)行擬合。由Origin軟件擬合數(shù)據(jù)得到副溶血性弧菌在即食蝦中的生長參數(shù)，結(jié)果如表1所示。

通過觀察非線性回歸的相關(guān)系數(shù)R2、殘差平方和RSS可以比較模型的擬合效果，R2越接近1，殘差平方和越小，模型的擬合效果越好[6]。比較表1數(shù)據(jù)可得，Gompertz模型對Real-time qPCR法所得數(shù)據(jù)的擬合效果最好，而Richards模型對涂布計數(shù)法所得數(shù)據(jù)的擬合效果最好。

圖1 37℃即食蝦中副溶血性弧菌生長曲線擬合結(jié)果Fig.1 The growth curves of Vibrio parahaemolyticus on ready-to-eat shrimp stored in 37℃

3 結(jié)論與討論

本實驗成功構(gòu)建了檢測副溶血性弧菌的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，并把Real-time qPCR這種分子生物學(xué)的方法運用于建立副溶血性弧菌生長預(yù)測模型。傳統(tǒng)的涂布計數(shù)方法需要選擇合適的稀釋梯度，并需通過選擇性培養(yǎng)基的篩選，而且實驗室常用的副溶血性弧菌的選擇性培養(yǎng)基硫代硫酸鹽-檸檬酸鹽-膽鹽-蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（TCBS）特異性不好，當(dāng)有其他弧菌存在時就會影響副溶血性弧菌的檢出率[7]。相較于傳統(tǒng)計數(shù)方法，Real-time qPCR定量方法只需提取樣品DNA，設(shè)計特異性引物，可以同時對多種微生物定量，而且能檢測到活的不可培養(yǎng)的菌（VBNC），基于這些優(yōu)勢近年來有很多利用定量PCR方法檢測食源性致病菌[8-10]。

Gompertz模型、Logistic模型和Richard模型是常用來擬合微生物S型生長的模型[9]。兩組數(shù)據(jù)均能用這三種模型進(jìn)行擬合，所得的相關(guān)系數(shù)均在0.9以上。Real-time qPCR方法所得數(shù)據(jù)用Gompertz模型擬合的效果最好，而傳統(tǒng)的涂布計數(shù)法數(shù)據(jù)用Richards模型擬合效果最好。由于用Real-time qPCR方法建模還處于初期階段，模型的選擇或開發(fā)還需進(jìn)一步研究，一些方法也還需要進(jìn)一步優(yōu)化，如DNA提取方法、PCR體系等。Robert-Pillot等[10]提出不同的DNA提取方法影響Q-PCR結(jié)果，所以需謹(jǐn)慎選擇DNA提取方法。

總結(jié)，基于Real-time qPCR的無需培養(yǎng)、速度快、特異性好等優(yōu)勢，運用Real-time qPCR方法建立微生物預(yù)測模型將是預(yù)測微生物學(xué)發(fā)展的一種趨勢。

[1]Florence P，Helene F，Sona P，et al.Recent advances in quantitative PCR（qPCR） applications in food microbiology[J].Food Microbiology，2011，28（5）：848-861.

[2]Burkhard M，Charlotta L，Martin W，et al.Enumeration of Salmonella Bacteria in Food and Feed Samples by Real-Time PCR for Quantitative Microbial Risk Assessment[J].Applied and Environmental Microbiology，2008，74（24）：1299-1304.

[3]Hagi T，Kobayashi M，Nomura M.Molecular-based analysis of changes in indigenous milk micro flora during the grazing period[J].Bioscience Biotechnology and Biochemistry，2010，74（3）：484-487.

[4]Hein I，Jorgensen H J，Loncarevic S，et al.Quantification of Staphylococcus aureus in unpasteu-rized bovine and caprine milk by real-time PCR[J].Research Microbiology，2005，156（4）：554-563.

[5]Andrew Staroscik[OL].http：//www.uri.edu/research/gsc/resources/cndna.html，2004-1-29/2013-1-20.

[6]馬開玉，張耀存，陳星.現(xiàn)代統(tǒng)計學(xué)[M].北京：氣象出版社，2004：136-138.

[7]Su YC，Duan JY，Wu WH.Selectivity and specificity of a chromogenic medium for detecting Vibrio parahaemolyticus[J].Journal of Food Qrotection，2005，68（7）：1454-1456.

[8]Chen J，Zhang L，Paoli G C，et al.A real-time PCR method for the detection of Salmonella enterica from food using a target sequence identified by comparative genomic analysis[J].International Journal of Food Microbiology，2010，137（2/3）：168-174.

[9]黃和，蔣志紅，雷曉凌，等.凍熟蝦中副溶血性弧菌生長模型[J].廣東海洋大學(xué)學(xué)報，2009，29（1）：94-98.

[10]Robert-Pillot A，Copin S，Gay M，et al.Total and pathogenic Vibrio parahaemolyticus in shrimp：Fast and reliable quantification by real-time PCR[J].International Journal of Food Microbiology，2010，143（3）：190-197.