伍 恒，張 翠，翁 震，徐德平，汪何雅，姚衛(wèi)蓉

（1.江南大學食品學院，江蘇無錫214000；2.福建源華林業(yè)生物科技有限公司，福建三明354500）

無患子又名肥皂樹，其果皮中含有豐富的無患子皂苷，是一種天然的非離子型表面活性劑，具有很強的降低表面張力的作用，泡沫豐富、手感細膩、去污力強。用從無患子果提取的皂苷制得的皂乳洗碗劑、蔬果清洗露、食品機械清洗劑等用于食品工業(yè)中不會帶來螢光劑、表面活性劑、人工激素、江河湖泊富營養(yǎng)化等負面問題，在一定程度上保證了食品安全；另外，無患子皂苷還能迅速分解，不會對環(huán)境造成任何污染。目前，國內(nèi)對無患子皂苷的研究仍處于初步階段，市面上沒有無患子皂苷的純品出售，關(guān)于其定性研究比較困難。關(guān)于皂苷的測定方法較多，主要有紫外分光光度法、薄層色譜法、高效液相色譜法、高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用法、氣相色譜法、高效毛細管電泳法等，以上分析方法各個側(cè)重點不同：比色法、紫外分光光度法比較適用于檢測總皂苷含量；薄層色譜法在中藥成分研究中應用較為廣泛；高效液相色譜法對于皂苷的定量檢測較方便，但需要昂貴的標準品做對照[1-2]；液質(zhì)聯(lián)用法能高效準確地對皂苷定性和定量[3-8]，但設備儀器價格昂貴，操作技術(shù)要求高。分光光度法已經(jīng)應用于人參總皂苷、酸棗仁皂苷、黃芪總皂苷等的測定中，證明了該方法是檢測總皂苷含量的方便有效地方法之一。

所以本文采用醇提-大孔樹脂吸附法自制無患子總皂苷標準品，經(jīng)Libermann-Buehard反應、溶血反應定性，并采用HPLC/MS方法初步鑒定無患子總皂苷成分，經(jīng)香草醛-冰醋酸比色法定量無患子總皂苷標準品純度。目前市面上涌現(xiàn)出越來越多的無患子皂苷產(chǎn)品，例如無患子蔬果清潔露、無患子洗碗露等，所得高純度皂苷可作為工藝研究的質(zhì)量控制標準品，同時也可作為食品工業(yè)上無患子皂苷產(chǎn)品中皂苷含量檢測的標準品。填補了市面上沒有高純度無患子總皂苷出售的空白，為進一步實驗研究打好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

無患子果皮 福建源華生物科技有限公司；95%乙醇、石油醚、正丁醇、香草醛、高氯酸（70%～72%）、冰醋酸、濃硫酸 分析純，國藥集團化學試劑有限公司；AB-8大孔樹脂 天津南開大學化學工廠；MCIgelCHP20P（75～150μm）柱填料 日本三菱化成公司；GF254薄層硅膠板 山東煙臺芝罘化工廠；齊墩果酸標準品 中國藥品生物制品檢定所；日本大耳白兔 北京百爾康納特實驗兔繁育生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

可調(diào)試移液器 Thermo Labsystems公司；PL2002型電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；GEN-14型電動微型粉碎機 四川自貢漸飛機械廠；W501型恒溫水浴鍋 上海申順生物科技有限公司；CQ-88-205型萃取罐 常州市特威電氣自動化系統(tǒng)有限公司；TU-1900型雙束紫外可見分光光度計 日本島津公司；Waters Synapt G2型超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Waters公司；R-501型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上海申順生物科技有限公司；SHBⅢ型循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 無患子總皂苷質(zhì)控品的制備

1.2.1.1 無患子粗皂苷的提取 將無患子果皮磨碎成20目左右，稱取5kg無患子粉末于提取罐中，加15kg 70%乙醇75℃下提取3h。將第一次提取液經(jīng)8層紗布過濾從罐底放出。濾渣留在提取罐中進行第二、三次提取，酒精濃度、酒精用量、提取時間和溫度與第一次提取相同，合并三次濾液并離心。采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)回收乙醇至浸膏狀。

1.2.1.2 無患子總皂苷的分離 將上述浸膏狀無患子粗皂苷分散至石油醚中萃取3次，棄去石油醚層，水相部分用正丁醇萃取5次，至正丁醇相幾乎沒有顏色，合并正丁醇相，減壓濃縮，加入適量蒸餾水，水溶液中加入5%Ca（OH）2混勻，放置2h使沉淀，去除粘液質(zhì)、鞣質(zhì)和部分黃酮，抽濾后得到無患子粗皂苷溶液繼續(xù)上AB-8大孔樹脂柱，流速約15mL/min，上樣量應低于柱體積的1/4。大孔樹脂預處理、裝柱及再生方法見文獻[9]。先用蒸餾水洗脫去除糖類、氨基酸、色素等水溶性雜質(zhì)，再用70%乙醇洗脫得無患子粗皂苷液，取出一部分干燥成粉末，HPLC-MS分析其成分。

1.2.1.3 無患子總皂苷的純化 將大孔樹脂分離所得無患子粗皂苷液濃縮，再加水稀釋至濃度約5%的水溶液，上樣MCI（聚苯乙烯基的反相樹脂填料）凝膠柱，分別用蒸餾水、30%、70%乙醇洗脫，減壓濃縮干燥得混合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，HPLC-MS、泡沫實驗、TLC檢測、Libermann-Buehard反應、溶血性實驗同步進行定性分析。

1.2.2 無患子皂苷的定性測定

1.2.2.1 HPLC-DAD/MS檢測條件 配制1mg/mL無患子粗皂苷液（大孔樹脂70%洗脫部分），進行HPLCDAD/MS檢測。檢測條件[10-11]如下：色譜柱為BEC C18柱（2.1mm×100mm，1.7μm），流動相A：甲醇，流動相B：水，起始時40%A，60%B；20min時80%A，20%B；25min時100%A，流速0.3mL/min，柱溫45℃，進樣量5μL。ESI離子源；正離子模式與負離子模式相互驗證，MRM多反應監(jiān)測，霧化N2壓力為275.8kPa，干燥N2流速9L/min，溫度為350℃，毛細管電壓為3.0kV，質(zhì)量范圍100～3000m/z，脫溶劑氣溫度250℃，離子源溫度120℃，DAD范圍190～400nm進行掃描。無患子皂苷正負離子流色譜圖見圖2、圖3。

1.2.2.2 Libermann-Buehard反應 組分Ⅲ粉末1mg，加乙酸酐溶解，隨后再加入乙酸酐-濃硫酸（1∶20）數(shù)滴，振搖[12]。觀察顏色變化，顏色的變化為黃-紅-紫-藍，顯示可能有三萜皂甙。

1.2.2.3 溶血反應 溶血反應是皂苷的特征反應，皂苷能導致血細胞破裂，因此可以利用溶血性來判斷樣品中是否含有皂苷。取大耳兔新鮮血液20mL，放入加有玻璃珠的三角瓶中，振搖10min除纖維蛋白后轉(zhuǎn)至刻度離心管中，加生理鹽水10mL混勻后1500r/min離心5min，除去上清液，再加適量生理鹽水離心，重復至上清液無色澄清。棄去上清液取2mL紅細胞，加入98mL生理鹽水，即配成2%的紅細胞懸浮液，備用[13]。配制混合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ水溶液1mg/mL，取試管4支，分別加入濾液0.25、0.5、0.75、1mL，然后依次分別加入生理鹽水2.25、2.0、1.75、1.5mL，使每一個試管中的溶液均為2.5mL，再將各試管加入2%的血細胞懸液2.5mL，振搖均勻后，立即置于37℃水浴中溫浴3h，以1500r/min離心5min，若實驗溶液呈澄明紅色，管底無細胞殘留或少量殘留，表明有溶血反應；若細胞全部下沉，上清液無色透明，表明無溶血現(xiàn)象發(fā)生[14]。

1.2.3 無患子總皂苷純度鑒定

1.2.3.1 齊墩果酸標準曲線制備 根據(jù)HPLC-MS分析結(jié)果，無患子總皂苷主要為齊墩果酸型三萜皂苷，所以選擇齊墩果酸作為無患子總皂苷元的標準品。齊墩果酸用甲醇溶解，配制成1mg/mL的溶液，取18支20mL比色管，編號1～6，每個編號三組平行，1～6號試管分別取0、200、400、600、800、1000μL齊墩果酸標準溶液，水浴揮干。每管加入0.4mL 5%（wt%）香草醛-冰醋酸溶液和1.4mL高氯酸溶液為顯色劑，搖勻，在70℃水浴加熱20min，冰水浴中冷卻3min，加入10mL冰醋酸為溶劑，搖勻，用分光光度計在400～600nm掃描光譜，并在550nm測吸光度[15]。

1.2.3.2 無患子總皂苷水解條件的確定 濃鹽酸水解法是通過皂苷經(jīng)水解后得到皂苷元，再經(jīng)換算得到相應皂苷的含量。無患子皂苷根據(jù)文獻[16]對于酸種類、酸濃度及水解時間都有一定的研究，但關(guān)于水解方式的比較方面報道甚少。本實驗比較了三種不同的水解方式：回流加熱、100℃水浴、高溫高壓。方法如下：

待測樣品的配制：精密稱取無患子總皂苷粉末1g，加33mL水溶解后，再加入17mL濃鹽酸使鹽酸濃度達到35%左右。

（a）回流加熱：組裝實驗室常用的回流冷凝裝置，將上述待測樣品置于100mL圓底燒瓶中，用油浴鍋在100℃回流加熱2h；

（b）100℃水?。簩⑸鲜龃郎y樣品置于100mL錐形瓶中，加硅膠塞密封，用水浴鍋在100℃加熱2h；

（c）高溫高壓：將上述待測樣品置于100mL錐形瓶中，加硅膠塞密封，用高壓蒸汽滅菌鍋在120℃，0.1MPa加熱2h。

將以上三種水解方式的產(chǎn)物用三氯甲烷振搖提取三次，合并提取液，回收溶劑至干，甲醇定容后待測定。

1.2.3.3 無患子總皂苷與齊墩果酸量比換算系數(shù) 齊墩果酸的分子式C30H48O3，分子量為456，按含量加權(quán)分析[17]推斷無患子總皂苷的平均分子量為882.5，與齊墩果酸的分子量在理論上的量比系數(shù)為1.94，考慮在無患子總皂苷水解過程中不能達到完全水解，無患子總皂苷元的得率有所損失，皂苷元最大得率達85%左右[18-19]，所以量比系數(shù)1.94除以85%即為加權(quán)系數(shù)2.3，無患子總皂苷含量的計算公式為：

無患子總皂苷的含量=試樣中齊墩果酸相當量（μg）×2.3

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔樹脂分離所得無患子粗皂苷液成分鑒定

圖1 無患子粗皂苷液的ESI檢測總離子流色譜圖Fig.1 ESI-total ion chromatograms of TSS

一般三萜皂苷類化合物的紫外吸收很弱，通過高效液相-紫外檢測（HPLC-UV）或高效液相-蒸發(fā)光散射（HPLC-ESCD）測定其含量較困難，且需要較昂貴的對照品。HPLC-MS檢測三萜皂苷類物質(zhì)靈敏度高，并能提供每個譜峰的分子量及結(jié)構(gòu)信息，在沒有對照品的情況下，可以快速鑒定出三萜皂苷類成分。本研究首先采用大孔樹脂初步分離純化得無患子粗皂苷液，為了判斷所得無患子粗皂苷液中的成分，選擇正離子和負離子兩種模式同步進行無患子粗皂苷的ESI-MS檢測，正、負離子模式下無患子粗皂苷成分總離子流色譜圖如圖1所示，可以看出其單體成分較多，很難完全分離，對主要色譜峰進行編號，編號為1～15。

正離子ESI-MS譜中出現(xiàn)各皂苷成分的[M+Na]+準分子離子峰，負離子ESI-MS譜中則為[M-H]-和[M+Cl]-準離子峰。通過正、負離子質(zhì)譜相互驗證，因為各單體很難完全分離，所以質(zhì)譜圖中會有一些碎片離子干擾，但主要的碎片離子可以較易從圖中讀出，并在相應的碎片離子上標明[M+Na]+、[M-H]-、[M+Cl]-，從而初步判斷無患子粗皂苷中主要單體的分子量，根據(jù)相關(guān)書籍[20]，初步推測無患子粗皂苷液中主要成分，結(jié)果見表1。

根據(jù)質(zhì)譜元素分析軟件Mass Lynx V4.1，可以初步判斷分子量1188、1086、1400為含氮或含硫化合物，屬于雜質(zhì)成分；6號組峰分子量均為1190，該類物質(zhì)王曉淳等[21]報道其性質(zhì)不穩(wěn)定，很難分離得到純品，結(jié)構(gòu)難以鑒定；8號組峰主要是分子量為1086與1232的混合峰，很難分開；分子量為1044和1128的物質(zhì)至今未見報道；分子量為1000、1002、1146、1148、1232的物質(zhì)屬于倍半萜糖苷類化合物；分子量為1206、1074、882、750、924、966的物質(zhì)為三萜皂苷類化合物，楊運云等[22]對復方毛冬青沖劑中三萜皂苷活性成分進行分析，報道了齊墩果酸型及烏索烷型三萜皂苷在一級正離子質(zhì)譜圖中均有m/z437特征離子，上述無患子三萜皂苷正離子ESI-MS中均有特征碎片峰m/z437，結(jié)果與楊運云等的報道相似，進一步確定了分子量為1206、1074、882、750、924、966為三萜皂苷，且主要為齊墩果酸型三萜皂苷。結(jié)合圖3和表1可知，4～10min出峰的主要是倍半萜糖苷類物質(zhì)，10～20min出峰的主要為三萜皂苷類物質(zhì)，且主要有8種三萜皂苷單體，這與Huang等[23]和Saxena等[24]報道的10～20min出現(xiàn)約7個三萜皂苷單體的報道相似。綜上所述，要得到純度較高的皂苷成分，還需要進一步分離，將倍半萜糖苷類物質(zhì)去除。

2.2 無患子總皂苷進一步純化

圖2 TLC同步檢測MCI柱分離結(jié)果Fig.2 The result of separation of MCI GEL by TLC detection

2.2.1 TLC同步監(jiān)測MCI柱分離結(jié)果 根據(jù)不同物質(zhì)在MCI柱上的吸附力不同，先用蒸餾水洗脫直至用薄層板檢測無檢出物，這部分合并即為組分Ⅰ；用30%乙醇洗脫至薄層板上無檢出物，合并洗脫液成組分Ⅱ；再用70%乙醇洗脫直至無目標物，合并洗脫液得組分Ⅲ，根據(jù)洗脫物保留時間不同可知組分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ是三類不同極性的物質(zhì)。

表1 無患子粗皂苷成分分析Table 1 Analysis of components of the total sapindus-saponins

2.2.2 HPLC-MS檢測組分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 結(jié)合表1所鑒定的無患子粗皂苷成分，編號對應圖3。根據(jù)分子量及出峰時間可以推斷無患子總皂苷主要集中在組分Ⅲ中，主要成分如下（括號內(nèi)為分子量）：Sapindoside B（882）、Sapindoside A（750）、Mukurozi-saponin E1（924）、Sapindoside L（924）、Mukurozi-saponin G（966）、Sapindoside M（966）；組分Ⅱ中也含有少量無患子三萜皂苷，分別為Mukurozi-saponinY（1206）和MukurozisaponinX（1074），出峰時間為10.02min，但因為其含量較少，且從組分Ⅱ中完全分離比較困難，所以本實驗未對組分Ⅱ進行進一步分離，組分Ⅲ即為本實驗所需無患子總皂苷質(zhì)控品，且根據(jù)峰面積可知組分Ⅲ中無患子總皂苷含量較高。

圖3 組分Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ的ESI檢測負離子流色譜圖Fig.3 ES-ion chromatograms of mixtureⅠ，Ⅱ，Ⅲ

2.2.3 組分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ性能驗證 經(jīng)Libermann-Buehard反應及溶血實驗，發(fā)現(xiàn)組分Ⅰ、Ⅱ的Libermann-Buehard反應無顏色變化，在較高濃度（0.3mg/mL）仍無溶血反應，說明幾乎不含皂苷或皂苷含量較少，這與HPLC-MS推測的結(jié)果一致；組分Ⅲ有明顯的皂苷的特性，Libermann-Buehard反應顏色由黃-紅-紫-藍，且在較低濃度（0.02mg/mL）時仍有溶血性，說明三萜皂苷含量較高，進一步斷定組分Ⅲ即所需無患子總皂苷質(zhì)控品。

2.3 無患子總皂苷純度的判定

通過MCI柱分離可知，組分Ⅲ為純度較高的無患子總皂苷，因為其含有相同的齊墩果酸型皂苷元，結(jié)構(gòu)相似，所以很難完全分離開，無法用面積歸一化法對其進行純度的計算。根據(jù)文獻[25]，通過將皂苷水解為皂苷元，再經(jīng)過加權(quán)系數(shù)分析，可以計算皂苷的含量。

圖4 齊墩果酸在香草醛-冰醋酸體系中紫外吸收Fig.4 The UV graph of olenolic acid in vanilin-acetic-HClO4system

2.3.1 齊墩果酸標準曲線 齊墩果酸通過香草醛-冰醋酸顯色后在400～600nm掃描，可知在550nm左右有最大吸收。以齊墩果酸為無患子三萜皂苷元的標準品，得回歸方程如下：y=0.0006x+0.0838，R2=0.9996，其中，x為齊墩果酸含量，y為吸光度。齊墩果酸含量在200～1000μg范圍內(nèi)與吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，可作為齊墩果酸型皂苷元質(zhì)量評價的標準曲線。

2.3.2 無患子總皂苷水解后的吸收特征 無患子總皂苷經(jīng)過水解得到皂苷元，經(jīng)過香草醛-冰醋酸顯色后，在550nm左右處有最大吸收，這與齊墩果酸標準品的最大吸收峰一致，進一步說明了該三萜皂苷元為齊墩果酸型皂苷元。

圖5 無患子皂苷元在香草醛-冰醋酸體系中紫外吸收Fig.5 The UV graph of sapindus-sapogenin in vanilin-acetic acid-HClO4system

2.3.3 無患子總皂苷水解條件的確定 從表2可以看出，當鹽酸濃度35%，水解2h時，高溫高壓方法下皂苷元得率最高，通過1.2.3.3的換算方法可知無患子總皂苷的純度可達95.2%。

表2 無患子皂苷水解條件的確定（n=3）Table 2 Comparation of hydrolysis conditions of the total sapindus-saponins（n=3）

3 結(jié)論

通過乙醇提取，石油醚除雜，正丁醇萃取，AB-8大孔樹脂，MCI凝膠柱分離純化得無患子總皂苷，鑒定主要為齊墩果酸型三萜皂苷，純度可達95.2%，可作為無患子總皂苷質(zhì)控品。無患子皂苷是一類結(jié)構(gòu)相似的混合物，由于其具有多樣性與復雜性，單個皂苷分離十分困難，關(guān)于無患子皂苷的化學組成的研究一直是一大難題。本文的研究內(nèi)容為進一步分離無患子皂苷單體奠定了堅實的基礎(chǔ)。

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