史海良

（國家食品質量安全監(jiān)督檢驗中心，北京100094）

苯并（a）芘（BaP），是一種常見的高活性間接致癌物[1]。苯并（a）芘（BaP）通過食物鏈在魚類、植物和軟體動物中發(fā)生生物蓄積，造成食物污染[2]。方便面是指通過對面條進行蒸煮、油炸等工藝制得，再佐以油醬、菜肉、粉料等調料包，經(jīng)過簡單沖泡即可食用的即食食品。方便面原料受到污染或者不適當?shù)挠驼赡苁狗奖忝嬷械腂aP含量升高[3]，2012年10月知名方便面品牌農心在韓國生產的6款方便面被卷入致癌物苯并（a）芘風波，消息引起各界高度關注。在食品苯并（a）芘的檢測中，根據(jù)檢測對象、富集提取方式的不同，使用的分析方法也不相同，主要有薄層層析法、熒光分光光度法、氣相色譜法、氣相色譜質譜法、高效液相色譜紫外法、高效液相色譜熒光法[4-9]，其中熒光法靈敏度高，重現(xiàn)性好，是較常用的方法[7-9]。目前，我國檢測食品中苯并（a）芘的標準方法主要有GB/T5009.27，GB/T22509，NY/T1666，SC/T3041等，這些方法通常存在樣品處理復雜、耗費試劑量大、檢測周期長等局限性。本實驗根據(jù)方便面中不同的食品材質，分別對方便面中的油醬料包，粉料、菜肉包和面餅采取不同的預處理方案，再用高效液相色譜熒光檢測法進行檢測，旨在建立一種試劑用量少、分離效果好、簡便快速的方便面中苯并（a）芘的檢測方法。本文采用HiCapt-Benzo苯并（a）芘專用固相萃取柱對基質較為復雜的方便面樣品進行凈化處理，有效排除基質干擾，再用高效液相色譜—熒光檢測器（HPLC-FLD）測定，靈敏度高，重現(xiàn)性好，有利于方便面中苯并（a）芘的準確快速的定性定量分析。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

苯并（a）芘標準品 中國計量科學研究院標物中心；HiCapt-Benzo苯并（a）芘專用柱 維泰克科技有限公司；乙腈 色譜純；水 超純水，正己烷，丙酮，乙酸乙酯，異丙醇 分析純。

Agilent1200高效液相色譜儀配熒光檢測器、Agilent SB-C18（4.6×250mm，5μm）色譜柱；TGL-16M離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司；高速分散機 IKA T18；渦旋混合器 Vortex-Genie 2；加壓固相萃取裝置 美國J2 scientific公司；N-EVAP111氮吹儀 美國儀器集團；BP112s天平 賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 試劑處理 正己烷、丙酮、乙酸乙酯、異丙醇分別進行重蒸，然后分別量取重蒸后的正己烷41.4mL、丙酮8mL和乙酸乙酯0.6mL混合后轉移入旋轉蒸發(fā)瓶中蒸發(fā)至近干，然后再用氮氣吹干，最后用0.2mL重蒸后異丙醇溶解，在液相熒光條件下檢不出苯并（a）芘為合格（注：以下實驗所使用試劑皆為重蒸處理后試劑，乙腈和水除外）。

1.2.2 提取流程

1.2.2.1 油醬料包預處理 40℃水浴溶解醬料包中的油脂，然后準確稱取0.4g（精確到0.0001g）左右樣品置于5mL試管中，然后用后正己烷2mL渦旋溶解，等待凈化。

1.2.2.2 粉料包，菜肉包，面餅預處理 準確稱取初步粉碎的樣品2g（精確到0.01g）左右置于50mL離心管中，加入2g無水硫酸鈉，加入15mL正己烷，勻漿處理2min，超聲提取5min，6000r/min離心2min，收集上清液置于50mL旋轉蒸發(fā)瓶中，然后再加入10mL正己烷溶解殘渣，重復上述過程兩次，合并正己烷提取液，用旋轉蒸發(fā)器40℃濃縮到1mL左右，轉移濃縮液到5mL試管中，用0.5mL正己烷淋洗蒸發(fā)瓶，合并溶液，然后用正己烷定容到2mL，等待凈化。

1.2.3 凈化 在HiCapt-Benzo柱中依次加入5mL丙酮，2mL正己烷活化。在柱中正己烷液面為2mm時上樣，將1.2.2.1和1.2.2.2得到的待凈化液加入HiCapt-Benzo柱中，此過程注意不要使柱干涸，再用200μL正己烷淋洗樣品管，一并加入SPE柱中，流出液棄去。待上樣液完全流出后，用3mL的乙酸乙酯∶正己烷=1∶4（V/V）溶液淋洗，淋洗液棄去，將SPE柱吹干。然后用3mL丙酮解吸，收集解吸液。解吸液40℃下用氮氣吹干，加入異丙醇200μL溶解并定容，待液相色譜熒光檢測。

1.2.4 液相色譜熒光檢測 檢測條件：色譜柱：Agilent SB-C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；流動相：乙腈∶水=88∶12（V/V）；流速：1.0mL；柱溫：30℃；進樣量：20μL；熒光檢測器：激發(fā)波長384nm，發(fā)射波長406nm。

2 結果與討論

2.1 試劑處理的效果

在富含多環(huán)芳烴的石油和煤工業(yè)產品中不可避免的存在苯并（a）芘（圖1），檢測苯并（a）芘中使用的大部分試劑都是石油和煤工業(yè)的產品，如何清除試劑中苯并（a）芘對檢測的干擾是一個必須要解決的問題，否則就會造成假陽性、定量不準確、重復性差等結果的出現(xiàn)。苯并（a）芘熔點179℃，沸點475℃，因此在重蒸餾的情況下可以完全的去除試劑中的干擾（圖2），盡可能的保證結果準確可信。

圖1 未重蒸試劑色譜圖Fig.1 Chromatogram of not redistillation reagents

圖2 重蒸后試劑色譜圖Fig.2 Chromatogram of redistillation reagents

2.2 提取溶劑的提取效率

實驗中考察了石油醚、無水乙醚、正己烷和環(huán)己烷作為提取劑的提取效果（表1）。加標回收率實驗發(fā)現(xiàn)正己烷和環(huán)己烷提取效果最好，考慮到和凈化步驟保持一致盡量減少使用試劑種類，減少試劑處理的工作量，降低試劑造成污染的可能性等因素，最終選用正己烷作為苯并（a）芘提取試劑。

表1 提取試劑的提取效果Table 1 Results of extraction reagents

2.3 凈化條件的選定

苯并（a）芘的檢測中廣泛使用的是中性氧化鋁柱、弗羅里硅土固相萃取柱和C18固相萃取柱[9]。中性氧化鋁使用前處理耗時較長，對活性的控制較難掌握，因此重現(xiàn)性較差；弗羅里硅土和C18固相萃取小柱，樣品溶解上樣后，用非極性試劑洗脫，也能取得良好的凈化效果和回收率。但是這兩種小柱在凈化過程中引入其他不同于提取溶劑的試劑，使試劑的處理更加復雜化，并有可能影響檢測結果。所以選用了HiCapt-Benzo苯并（a）芘專用柱，在有效去除油脂中的中性脂肪和維生素等基質干擾的同時，盡量簡化凈化方法使其簡單、快速，使用溶劑與提取溶劑相一致，且回收率穩(wěn)定、重現(xiàn)性良好。

2.4 液相色譜儀與熒光檢測器的設定

實驗參考GB/T22509的流動相組成，比較了不同比例的乙腈與水作流動相的效果，實驗發(fā)現(xiàn)，乙腈的比例對目標物出峰時間影響比較大，乙腈比例較大時，洗脫能力較強，可以縮短苯并（a）芘的保留時間，但此時樣品中其他雜質會發(fā)生重疊；減小乙腈比例可以改善樣品溶液中各個色譜峰的分離度，但苯并（a）芘的保留時間延長，操作費時。在本文實驗條件下，當乙腈∶水=88∶12（V/V），流速為1.0mL/min，柱溫30℃，熒光激發(fā)波長384nm，發(fā)射波長406nm時，苯并（a）芘出峰時間合適，峰形較好并能與基體雜質分開（圖3、圖4）。

圖3 苯并（a）芘（10.0μg/L）標準樣品色譜圖Fig.3 Chromatogram of the Benzo（a）pyrene（10.0μg/L）standard solution

圖4 苯并（a）芘陽性樣品色譜圖Fig.4 Chromatogram of the Benzo（a）pyrene in positive sample

2.5 方法的線性范圍、定量限、回收率和精密度

在1.0～200μg/L濃度范圍內，分別配制苯并（a）芘濃度為1.0、5.0、20、50、100、200μg/L的標準溶液，以峰面積（Y）與苯并（a）芘濃度（X，μg/L）繪制標準工作曲線。結果表明，在1.0～200μg/L濃度范圍內，苯并（a）芘呈良好線性關系，線性方程Y=2.582X+1.410，相關系數(shù)（R2）為0.9998，測定低限（S/N≥10）油料包為0.5μg/kg，粉料包和面餅0.1μg/kg。

選擇空白方便面樣品（圖5），在優(yōu)化后的實驗條件下，對方便面樣品進行加標回收率實驗，苯并（a）芘的加標濃度選為高中低三個濃度分別為1.0、5、20μg/kg，每個水平進行6次平行實驗，各加標濃度的回收率和精密度見表2。結果表明，添加濃度1.0～20μg/kg時，回收率范圍78.1%～96.7%，相對標準偏差0.97%～6.23%，符合苯并（a）芘檢測的要求。

表2 空白方便面中樣品中苯并（a）芘加標回收率和和相對標準偏差（n=6）Table 2 Recoveries and RSD of Benzo（a）pyrene in the instant noodles（n=6）

圖5 苯并（a）芘空白樣品圖Fig.5 Chromatogram of the Benzo（a）pyrene in blank sample

3 結論與討論

方便面中的苯并（a）芘來源有兩個可能的途徑：一是原料受到污染，主要是調味油醬、調味粉料等容易帶入；二是在生產過程中不適當?shù)挠驼ㄓ锌赡苁姑骘炛械谋讲ⅲ╝）芘含量升高；針對動植物油脂和肉類的苯并（a）芘檢驗方法比較多，主要有皂化法、固相萃取法、液液萃取法等[10]，針對面條等糧食制品中的苯并（a）芘檢驗方法較少主要是液液萃取法[5]，本文同時針對方便面中苯并芘不同的來源采用不同的提取方法，然后采用相同的凈化條件既充分保證提取的效率，又兼顧了實驗室工作的效率。苯并（a）芘檢測的難點在于有效的排除干擾，干擾包括使用試劑帶入和樣品基質中固有兩部分，試劑處理是苯并（a）芘檢測排除假陽性的一個關鍵性步驟，在一些試劑中曾發(fā)現(xiàn)苯并（a）芘含量甚至超過食品標準限量的現(xiàn)象，同時樣品前處理的結果將直接影響檢測結果的準確性和可靠性。本研究中所有試劑都經(jīng)過處理，并且檢驗合格，保證實驗所使用試劑不會對檢驗結果形成干擾和影響；樣品經(jīng)勻漿、超聲萃取、離心分離上清，再經(jīng)苯并（a）芘專用固相萃取柱凈化，有效排除了中性脂肪和維生素等基質因素對目標峰的干擾，得到的色譜圖背景干凈，色譜峰形好。該法樣品前處理比較簡單，分離效果好，且準確性和重復性好，滿足于方便面中苯并（a）芘含量的測定，各項技術指標均符合檢測要求。

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