彭友舜，黃云祥，鄭旭靜，范海華，張運(yùn)英

（1.河北科技師范學(xué)院，河北秦皇島066000；2.河北省蘆筍工程技術(shù)研究中心，河北秦皇島066000；3.秦皇島長(zhǎng)勝農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司，河北秦皇島066000）

蘆筍（Asparagus officinalis），學(xué)名石刁柏，又名龍須菜、文山竹等，是百合科天門(mén)冬屬多年生宿根性草本植物。在歐洲其消費(fèi)量?jī)H次于番茄、青刀豆、蘑菇和豇豆，國(guó)際市場(chǎng)上被稱為“蔬菜之王”。蘆筍中含有游離氨基酸、維生素、微量元素（鋅、銅、錳、硒等）等多種營(yíng)養(yǎng)成分，以及皂苷、多糖、黃酮等藥用成分[1-2]。其中蘆筍多糖具有抗腫瘤、抗衰老、抗疲勞、降血脂、保肝解毒、免疫調(diào)節(jié)等多種生理活性[3-4]。有關(guān)蘆筍多糖的研究在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域已成為新的熱點(diǎn)，并顯示出越來(lái)越廣闊的應(yīng)用前景。

植物中多含有蛋白質(zhì)，利用植物提取的多糖中因蛋白質(zhì)等物質(zhì)常常影響植物多糖的純度，導(dǎo)致其生理活性出現(xiàn)較大差異[5]。脫除蛋白質(zhì)方法及報(bào)道很多，應(yīng)用于不同原料的效果均有所不同，因此，蘆筍多糖脫除蛋白質(zhì)方面的研究具有實(shí)際應(yīng)用意義。

除蛋白是多糖分離純化過(guò)程中的首要和關(guān)鍵環(huán)節(jié)。常用的除蛋白方法有Sevage法、三氯乙酸-正丁醇法等。本實(shí)驗(yàn)受秦皇島長(zhǎng)勝農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司的委托，研究蘆筍多糖脫除蛋白工藝，以期為多糖生產(chǎn)過(guò)程中的純化工序提供適宜的脫蛋白方法及工藝參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蘆筍粗多糖 秦皇島長(zhǎng)勝農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司（多糖含量83.8%，蛋白質(zhì)含量5.3%）；牛血清蛋白CBBG250 西安周鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司；考馬斯亮藍(lán)G-250 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；D-無(wú)水葡萄糖 中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)為110833-200503；其余試劑 均為分析純。

UV-2401PC型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津公司；HZQ-QG型恒溫振蕩器 哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；KQ-200KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲波儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 多糖含量的測(cè)定 按苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量[6]。按下式計(jì)算多糖保留率：

式中：X1—多糖保留率，%；C0—脫蛋白前溶液中的多糖濃度，單位為mg/mL；Ct—脫蛋白后溶液中的多糖濃度，單位為mg/mL。

1.2.2 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定 按考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量[7]，按下式計(jì)算蛋白質(zhì)脫除率：

式中：X2—蛋白脫除率，單位為%；C0′—脫蛋白前溶液中的蛋白質(zhì)濃度，單位為mg/mL；Ct′—脫蛋白后溶液中的蛋白質(zhì)濃度，單位為mg/mL。

1.2.3 脫蛋白方法 稱取8.0g蘆筍多糖粉末，加蒸餾水溶解定容至1000mL，即為8mg/mL的蘆筍多糖母液。

1.2.3.1 Sevage法 設(shè)置Sevage試劑與樣液體積比、氯仿與正丁醇體積比、振蕩時(shí)間、靜置時(shí)間以及除蛋白次數(shù)5個(gè)因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，按最優(yōu)脫蛋白次數(shù)3次進(jìn)行均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，設(shè)置Sevage試劑與樣液體積比（x1）、氯仿與正丁醇體積比（x2）、振搖時(shí)間（x3）和靜置時(shí)間（x4）4個(gè)因素進(jìn)行均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，以綜合指數(shù)為考察指標(biāo)，選用均勻設(shè)計(jì)表進(jìn)行均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

1.2.3.2 三氯乙酸-正丁醇法 設(shè)置三氯乙酸溶液與正丁醇的體積比、多糖溶液與三氯乙酸-正丁醇溶液的體積比、振蕩時(shí)間、靜置時(shí)間及脫蛋白次數(shù)5個(gè)因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，按最優(yōu)脫蛋白次數(shù)3次進(jìn)行均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，設(shè)置三氯乙酸與正丁醇體積比（x1）、樣液與三氯乙酸-正丁醇試劑體積比（x2）、振蕩時(shí)間（x3）、靜置時(shí)間（x4）4個(gè)因素進(jìn)行均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，以綜合指數(shù)為考察指標(biāo)，選用均勻設(shè)計(jì)表進(jìn)行均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。

1.3 數(shù)據(jù)處理

表1 Sevage法均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的因素水平表Table 1 Table of factors and levels for Sevage method uniform design experiment

表2 三氯乙酸-正丁醇法均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 2 Table of factors and levels for trichloroacetic acid n-butanol method uniform design experiment

1.3.1 綜合指數(shù)的確定 工業(yè)化生產(chǎn)需要綜合考慮產(chǎn)品產(chǎn)量和產(chǎn)品品質(zhì)，對(duì)不同的產(chǎn)品需求，這兩個(gè)因素各有所側(cè)重。根據(jù)長(zhǎng)勝農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司所生產(chǎn)產(chǎn)品的使用方向，確定多糖保留率、蛋白質(zhì)脫除率兩個(gè)因素并重的原則。

綜合指數(shù)計(jì)算綜合指數(shù)=多糖保留率×50%+蛋白質(zhì)脫除率×50%

1.3.2 數(shù)據(jù)處理方法 所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次，圖表中實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差（M±SD）表示，使用Data Processing System（DPS V6.55）作圖及進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線

以葡萄糖濃度（x）為橫坐標(biāo)、吸光度（y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：y=2.8860x-0.0537，R2=0.9986，在葡萄糖濃度0.10～0.30mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2 蛋白質(zhì)含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線

以牛血清蛋白濃度（x）為橫坐標(biāo)、吸光度（y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：y=6.325x-0.1104，R2=0.9988，在蛋白質(zhì)濃度0.07～0.15mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3 Sevage均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)

根據(jù)表1，通過(guò)DPS V6.55軟件進(jìn)行均勻設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表3。

以綜合指數(shù)為目標(biāo)函數(shù)，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行偏最小二乘回歸建模，采用偏最小二乘二次多項(xiàng)式回歸方法進(jìn)行分析，其模型如下：

Y=6.4503571+15.966194x1+15.198930x2+1.451433x3+1.459576x4-3.576026x12-1.791135x22-0.021525x32-0.021272x42+0.067455x1x2-0.047917x1x3+0.012389x1x4-0.064351x2x3-0.067252x2x4+0.007941x3x4，R2=0.9783。

各因變量與各自變量標(biāo)準(zhǔn)回歸系數(shù)關(guān)系見(jiàn)表4。

由表4中x1、x2、x3、x4所對(duì)應(yīng)的Y值可知，四個(gè)因素對(duì)Sevage法脫除蘆筍多糖中蛋白質(zhì)的綜合指標(biāo)影響大小順序?yàn)椋簒4＞x1＞x3＞x2，即靜置時(shí)間＞Sevage試劑與樣液體積比＞振搖時(shí)間＞氯仿與正丁醇體積比。

表3 Sevage法均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果Table 3 Scheme and results of Sevage method uniform design experiment

表4 Sevage法標(biāo)準(zhǔn)回歸系數(shù)表Table 4 Table of standard regression coefficients on Sevage method

對(duì)模型求解得到Sevage法脫除蘆筍多糖蛋白質(zhì)最佳條件，見(jiàn)表5。

表5 Sevage法最優(yōu)因素組合表Table 5 Table of optimal factor combination on Sevage method

在Sevage試劑與樣液體積比1∶2、氯仿與正丁醇體積比3∶1、振蕩時(shí)間34min、靜置時(shí)間36min的條件下，進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，重復(fù)三次，得出多糖保留率為85.92%±0.15%，蛋白質(zhì)去除率為42.68%±0.10%，平均綜合指數(shù)為96.89%±0.26%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與模型預(yù)測(cè)的目標(biāo)函數(shù)誤差為0.08%，認(rèn)定該模型有效。

2.4 三氯乙酸-正丁醇均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)

根據(jù)表2，通過(guò)DPS V6.55軟件進(jìn)行均勻設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表6。

以綜合指數(shù)為目標(biāo)函數(shù)，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行偏最小二乘回歸建模，采用偏最小二乘二次多項(xiàng)式回歸方法進(jìn)行分析，其模型如下：

y=-3.0560471+1.460256x1+21.401348x2+1.512811x3+1.130809x4-0.050230x12-9.314793x22-0.015192x32-0.004408x42+0.234144x1x2+0.000346x1x3+0.001174x1x4-0.049095x2x3-0.009058x2x4-0.009670x3x4，R2=0.9569。

由表7中x1、x2、x3、x4所對(duì)應(yīng)的y值可知，采用三氯乙酸-正丁醇法脫除蘆筍多糖中的蛋白質(zhì)，各因素影響的主次順序?yàn)椋簒4＞x3＞x2＞x1，即靜置時(shí)間＞振蕩時(shí)間＞樣液與三氯乙酸-正丁醇體積比＞三氯乙酸溶液與正丁醇的體積比。

表6 三氯乙酸-正丁醇法均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果Table 6 Scheme and results of trichloroacetic acid n-butanol method uniform design experiment

表7 三氯乙酸-正丁醇法標(biāo)準(zhǔn)回歸系數(shù)表Table7 Table of standard regression coefficients on trichloroacetic acid n-butanol method uniform design experiment

對(duì)模型求解得到三氯乙酸-正丁醇法脫除蘆筍多糖蛋白質(zhì)最佳條件，見(jiàn)表8。

表8 三氯乙酸-正丁醇法最優(yōu)因素組合表Table 8 Table of optimal factor combination on trichloroacetic acid n-butanol method

設(shè)定三氯乙酸-正丁醇試劑中三氯乙酸溶液與正丁醇的體積比1∶20、三氯乙酸-正丁醇與多糖溶液的體積比1∶2、振蕩時(shí)間39min、靜置時(shí)間60min的條件下，進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，重復(fù)三次，得出多糖保留率為66.21%±0.11%，蛋白質(zhì)去除率為91.49%±0.30%，平均綜合指數(shù)為98.48%±0.32%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與模型預(yù)測(cè)的目標(biāo)函數(shù)值誤差為0.08%，認(rèn)定該模型有效。

3 結(jié)論

Sevage法為：在Sevage試劑與樣液體積比1∶2、氯仿與正丁醇體積比3∶1、振蕩時(shí)間34min、靜置時(shí)間36min工藝條件下，多糖保留率為85.92%±0.15%，蛋白質(zhì)去除率為42.68%±0.10%，平均綜合指數(shù)為96.89%±0.26%。三氯乙酸-正丁醇法為：在三氯乙酸溶液與正丁醇的體積比1∶20、三氯乙酸-正丁醇與多糖溶液的體積比1∶2、振蕩時(shí)間39min、靜置時(shí)間60min工藝條件下，多糖保留率為66.21%±0.11%，蛋白質(zhì)去除率為91.49%±0.30%，平均綜合指數(shù)為98.48%±0.32%。

綜上可知，三氯乙酸-正丁醇法脫除蘆筍多糖蛋白質(zhì)的效果優(yōu)于Sevage法。

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