魯吉珂，古國峰，汪 瑞，胡 甜，郝利民，余堅勇，王英澤

（1.鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南鄭州450001；2.總后軍需裝備研究所，軍用漢麻材料研究中心，北京100027）

蟬花（Cordyceps sobolifera），又名胡蟬、蟬菌、蟬蛹草、金蟬花等，是由蟲草屬真菌感染蟬科昆蟲，于蟲體前段長出花蕾狀子座，故名蟬花[1]。蟬花是一種菌蟲復(fù)合體，其中的活性組分與冬蟲夏草相當(dāng)，屬于優(yōu)質(zhì)蟲草[2]，具有抗應(yīng)激、抗疲勞、抗缺氧、調(diào)節(jié)免疫功能等多種功效[3-5]。蟬花中除含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪和微量元素等營養(yǎng)成分外[6]，還含有多糖、蟲草素、蟲草酸、腺苷和多球殼菌素等多種活性成分[7-8]。多糖是由10個以上單糖聚合而成的天然高分子化合物，具有抗氧化、抗腫瘤、抗病毒和免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性[9]。國外關(guān)于蟬花多糖的研究較少，國內(nèi)研究主要集中在蟬花多糖提取、純化及活性功效方面[10-11]。姚婷等[12]采用微波輔助提取法，對來自湖州吳興的金蟬花中多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，多糖最高提取率為2.96%。余文娟等[13]對江西廬山地區(qū)蟬花中多糖的超聲輔助提取工藝進(jìn)行研究，正交實驗結(jié)果表明最優(yōu)提取條件為70℃、提取30min、料液比1∶20（g∶mL），蟬花多糖提取率為2.37%。周俐斐等[14]采用水提醇沉法提取水溶性粗多糖，經(jīng)Sevag法除蛋白、透析、活性炭脫色、過濾、濃縮干燥后蟬花總多糖提取率為0.97%。目前不同研究組測得蟬花多糖含量差異較大，且多糖提取率計算方法尚未統(tǒng)一。本研究以浙江蟬花為原料，對其中蟬花多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期為蟬花功效物質(zhì)的制備應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蟬花 采自浙江臺州，采后洗凈，60℃烘干，粉碎粒度150目；葡萄糖、濃硫酸、苯酚、氯仿、正丁醇 均為分析純。

Beckman高速離心機 美國Beckman公司；UV-1700紫外分光光度儀 日本Shimadzu Corporation；電熱恒溫水浴鍋 北京市永光明醫(yī)療儀器廠；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵 鞏義市予華儀器有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海智城分析儀器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蟬花多糖的制備 稱取蟬花干粉100g，置于燒杯中，按料液比1∶10（g∶mL）加入超純水1000mL，90℃水浴浸提180min，減壓過濾收集濾液。濾渣再加700mL水，90℃水浴180min，抽濾，合并兩次濾液，65℃減壓蒸餾，濃縮上清液加入4倍體積的95%乙醇，4℃沉淀12h，4000r/min離心15min，傾去上清液，得粗多糖沉淀。

沉淀超純水溶解，活性炭75℃水浴150min，間歇攪拌，4000r/min離心15min，上清液中加入2.4倍體積的Sevag試劑（氯仿∶正丁醇=4∶1），振蕩后靜置30min，4000r/min離心15min，上清液重復(fù)以上步驟6～8次，直至不再出現(xiàn)沉淀，清液減壓蒸餾，再醇析一次，得到蟬花多糖沉淀，用無水乙醇反復(fù)洗滌2～3次，真空干燥后備用。

1.2.2 苯酚-硫酸法測定多糖提取率

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 將葡萄糖配制成一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用苯酚-硫酸法于490nm處測量吸光值[15]，以葡萄糖濃度C（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程為：A=5.1971C-0.0031（R2=0.9991）。

1.2.2.2 換算因子的測定 稱取干燥恒重的蟬花多糖50.00mg，置于50mL容量瓶中，加超純水定容。再分別吸取此溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0mL，置于試管中，補加超純水至10mL，按1.2.2.1步驟測定吸光值，按照式（1）計算換算因子f。

式中：W：蟬花多糖的質(zhì)量（mg）；C：蟬花多糖溶液中葡萄糖濃度（mg/mL）；D：稀釋因子（mL）。

經(jīng)3次測量取平均值，f=2.68。

1.2.2.3 苯酚-硫酸法計算多糖提取率 按照1.2.5中步驟，將提取濃縮醇沉的沉淀超純水定容，取待測溶解液1.0mL于試管中，按1.2.2.1步驟測定吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線與換算因子計算蟬花粉中多糖提取率，見式（2）。

式中：C：蟬花多糖溶液中葡萄糖濃度（mg/mL）；D：稀釋因子（mL）；f：換算因子；W：蟬花干粉質(zhì)量（mg）。

1.2.3 稱量法測蟬花多糖提取率 按照1.2.5中步驟，提取蟬花粗多糖沉淀，真空干燥后精確稱重，多糖提取率計算見式（3）。

式中：W1：蟬花多糖質(zhì)量（mg）；W：蟬花干粉質(zhì)量（mg）。

1.2.4 總糖含量的測定 將1.2.5中制備的蟬花提取液用超純水稀釋適當(dāng)?shù)谋稊?shù)，按1.2.2.1步驟測定吸光值，再由標(biāo)準(zhǔn)曲線計算提取液中蟬花總糖的提取率，見式（4）。

式中：C：蟬花提取液中葡萄糖濃度（mg/mL）；V：提取液總體積（mL）；W：蟬花干粉質(zhì)量（mg）。

1.2.5 蟬花多糖提取單因素優(yōu)化 稱取蟬花干粉1.00g，置于錐形瓶中，加入一定體積超純水，水浴加熱浸提一定時間，提取液減壓過濾，殘渣重復(fù)浸提步驟若干；合并濾液，減壓蒸餾，濃縮液醇沉，沉淀超純水定容，測定蟬花多糖含量并計算提取率。分別以提取溫度、提取時間、料液比和提取次數(shù)4個因素為對象，考察其對蟬花多糖提取率的影響。

1.2.6 蟬花多糖提取的正交實驗 在單因素優(yōu)化結(jié)果的基礎(chǔ)上，以提取溫度、提取時間、料液比和提取次數(shù)為影響因素，各取4個水平，采用L16（45）正交表進(jìn)行正交實驗設(shè)計，以多糖的提取率為指標(biāo)，確定蟬花多糖的最適提取工藝。因素水平表見表1。

表1 因素水平表Table 1Factors and levels for L16（45）orthogonal experiment design

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素優(yōu)化

2.1.1 提取溫度的確定 多糖含量測定主要有苯酚-硫酸法和直接稱量法。為考察提取溫度對蟬花多糖提取率的影響，分別采用這2種方法計算提取率，結(jié)果如圖1所示。稱量法提取率測定結(jié)果波動較大，主要原因在于抽濾及沉淀轉(zhuǎn)移步驟存在較大的誤差。苯酚-硫酸法的測定結(jié)果相對較為穩(wěn)定。圖1中溫度為60℃和90℃時蟬花多糖提取率較高，分別為4.61%和4.3%，100℃時提取率降低至2.9%。因此蟬花多糖提取溫度應(yīng)控制在50～90℃之間。

圖1 提取溫度對蟬花多糖提取率的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on the polysaccharide yield

2.1.2 提取時間的確定 采用苯酚-硫酸法測天然產(chǎn)物提取液中糖類物質(zhì)含量時，可以采用2種方法。其一：可直接對提取液于490nm處測吸光值，計算提取液中的總糖含量；其二：可將提取液濃縮醇沉的沉淀用水溶解，再對溶解液于490nm處測吸光值，計算提取液中的多糖含量。分別用上述2種方法計算蟬花中總糖和多糖的提取率，結(jié)果如圖2所示。120min時總糖提取率為18.75%，而相同條件下多糖提取率為5.4%。由于蟬花提取液中含有較多的色素等雜質(zhì)，包括一些小分子糖類物質(zhì)，都會干擾多糖測定，因此應(yīng)采用提取液濃縮醇沉再溶解的方法計算多糖提取率。隨著提取時間的增加，多糖提取率逐漸增加，由60min的4.86%增加到240min的6.01%，隨后繼續(xù)增加提取時間至300min，多糖提取率為6.1%（圖2）?？紤]到增加提取時間會增加成本及能耗，蟬花多糖的最適提取時間應(yīng)控制在60～240min之間。

圖2 提取時間對蟬花多糖提取率的影響Fig.2 Effect of extraction time on the polysaccharide yield

2.1.3 料液比的確定 料液比對天然產(chǎn)物活性物質(zhì)提取率的影響較大，適當(dāng)增加溶劑用量會提高提取率，但過多的溶劑用量會導(dǎo)致后續(xù)處理步驟繁瑣反而降低提取率。如圖3所示，蟬花多糖提取率隨料液比的增大呈先增加后降低的趨勢。在料液比為1∶30時，多糖提取率最高，為4.11%，繼續(xù)增加溶液量到1∶60，提取率降低為3.62%。蟬花多糖最佳提取料液比應(yīng)控制在1∶30左右。

圖3 料液比對蟬花多糖提取率的影響Fig.3 Effect of extraction solid-liquid ratio on the polysaccharide yield

2.1.4 提取次數(shù)的確定 提取次數(shù)對蟬花多糖提取率的影響如圖4所示。隨著提取次數(shù)的增加，多糖提取率逐漸增加，但增幅變小。蟬花多糖1次提取率為4.62%，提取4次總提取率為5.83%，繼續(xù)增加提取次數(shù)，提取率維持在5.8%左右?？紤]到增加提取次數(shù)會導(dǎo)致產(chǎn)品后處理的難度，蟬花多糖的最適提取次數(shù)應(yīng)控制在1～4次之間。

2.2 正交實驗結(jié)果

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，以提取溫度、提取時間、料液比和提取次數(shù)為考察因素，各取4個水平，設(shè)計正交實驗表（表1），對蟬花多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見表2。

圖4 提取次數(shù)對蟬花多糖提取率的影響Fig.4 Effect of extraction times on the polysaccharide yield

表2 蟬花多糖提取正交實驗結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiment for polysaccharide extraction from Cordyceps sobolifera

由表2極差分析結(jié)果可知，各因素對蟬花多糖提取率的影響順序依次為：提取溫度（A）＞提取次數(shù)（D）＞料液比（B）＞提取時間（C）。最佳提取條件為A4B4C4D4，即溫度90℃，料液比1∶40（g∶mL），提取240min，連續(xù)提取4次。在最佳工藝條件下進(jìn)行3次平行實驗驗證，蟬花多糖平均提取率為11.82%，均高于表2中其他組合的提取率。姚婷等[12]采用微波輔助提取法，金蟬花原料來自湖州吳興，多糖提取率計算采用苯酚-硫酸法（其計算步驟未體現(xiàn)多糖換算因子），多糖最高提取率為2.96%，低于本實驗優(yōu)化結(jié)果。余文娟等[13]以相同的多糖提取率計算方法，采用超聲輔助提取工藝，蟬花原料來自江西廬山地區(qū)，蟬花多糖最優(yōu)提取率為2.37%，也低于本實驗優(yōu)化結(jié)果。周俐斐等[14]采用直接稱量法，蟬花總多糖提取率為0.97%。溫魯?shù)萚2]對南京瓦屋山地區(qū)的蟬花中活性組分進(jìn)行分析，其中多糖含量為9.488%，與本研究結(jié)果較為相近。

3 結(jié)論

通過實驗對蟬花多糖的測定方法進(jìn)行了確定，采用苯酚-硫酸法對提取液濃縮醇沉再溶后進(jìn)行分析，計算多糖提取率。正交實驗結(jié)果顯示，各因素對蟬花多糖提取率影響順序依次為：提取溫度＞提取次數(shù)＞料液比＞提取時間。最佳提取條件為：溫度90℃，料液比1∶40（g∶mL），提取240min，連續(xù)提取4次。在此條件下，蟬花多糖提取率為11.82%。多糖是蟬花的重要生理活性物質(zhì)之一，對其提取工藝進(jìn)行研究，可為蟬花的活性物質(zhì)研究奠定基礎(chǔ)。

[1]許勝杰，葉淑幸，陳勁初.新資源食品蟬花菌絲體的開發(fā)[J].食藥用菌，2011，19（6）：34-38.

[2]溫魯，唐玉玲，張平.蟬花與有關(guān)蟲草活性成分檢測比較[J].江蘇中醫(yī)藥，2006，27（1）：45-46.

[3]官宗華，宋玉良.蟬花的研究概況[J].中國中藥指南，2012，10（10）：443-444.

[4]Weng S-C，Chou C-J，Lin L-C，et al.Immunomodulatory functions of extracts from the Chinese medicinal fungus Cordyceps cicadae[J].Journal of Ethnopharmacology，2002，83（1-2）：79-85.

[5]Wu M-F，Li P-C，Chen C-C，et al.Cordyceps sobolifera extract ameliorates lipopolysaccharide-induced renal dysfunction in the rat[J].The American Journal of Chinese Medicine，2011，39（3）：523-535.

[6]俞瀅，顧蕾，陳啟琪，等.蟬花的化學(xué)成分分析[J].杭州師范學(xué)院學(xué)報，1997（6）：61-63.

[7]余佳文.蟬花中多球殼菌素類長鏈堿的測定方法學(xué)研究及代謝輪廓分析[D].重慶：重慶大學(xué)，2009.

[8]Wang S-X，Liu Y，Zhang G-Q，et al.Cordysobin，a novel alkaline serine protease with HIV-1 reverse transcriptase inhibitory activity from the medicinal mushroom Cordyceps sobolifera[J].Journal of Bioscience and Bioengineering，2012，113（1）：42-47.

[9]徐曉飛，陳健.多糖含量測定的研究進(jìn)展[J].食品科學(xué)，2009，30（21）：443-448.

[10]何曉波，蘆柏震，周俐斐，等.蟬花總多糖對細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)的促進(jìn)作用[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2010，28（7）：1465-1468.

[11]朱燕，程東慶.蟬花多糖抗氧化活性的測定[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2009，27（7）：1552-1554.

[12]姚婷，羅靖，宋捷民.金蟬花多糖的微波輔助提取工藝研究[J].江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2012，24（5）：73-76.

[13]余文娟，許明敏，潘麗輝，等.蟬花多糖超聲波輔助提取工藝的優(yōu)化[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，51（20）：4598-4600.

[14]周俐斐，蘆柏震，蔡菊芬.蟬花總多糖的提取純化及含量測定[J].江西中醫(yī)藥，2009，40（1）：56-57.

[15]郝利民，張建春，魯吉珂，等.云南種植瑪咖中多糖提取工藝的優(yōu)化研究[J].食品工業(yè)科技，2013（3）：262-264.