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        HPLC法測(cè)定人血漿中異煙肼、吡嗪酰胺濃度

        2014-08-15 10:06:20丁紅梓周秋云錢(qián)智磊
        實(shí)用藥物與臨床 2014年12期
        關(guān)鍵詞:磷酸二氫鉀異煙肼血藥濃度

        陸 磊,王 潔,丁紅梓,周秋云,錢(qián)智磊,張 亮

        0 引言

        我國(guó)是全球22個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一,世界衛(wèi)生組織估計(jì),目前我國(guó)結(jié)核病年發(fā)病例數(shù)約為130萬(wàn),位居全球第二位[1]。同時(shí),我國(guó)也是全球27個(gè)耐多藥高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一[2]。雖然我國(guó)在遏制結(jié)核病蔓延和流行的實(shí)際工作中取得了初步成效,但是要順利實(shí)現(xiàn)我國(guó)結(jié)核病防治規(guī)劃目標(biāo),仍然面臨著諸多挑戰(zhàn)[3]。

        異煙肼(Isoniazid,INH)、吡嗪酰胺(Pyrazinamide,PZA)是用于結(jié)核病患者初始治療的重要用藥,大部分患者都可以獲得很好的治療效果[4]。PZA與INH化學(xué)結(jié)構(gòu)相似,故可能通過(guò)與INH相似的機(jī)制破壞肝細(xì)胞。有報(bào)道,應(yīng)用INH產(chǎn)生肝毒性的患者聯(lián)合應(yīng)用利福平和PZA后將出現(xiàn)更嚴(yán)重的肝損害[5]。INH和PZA的極性相差較小,使用同一流動(dòng)相同時(shí)測(cè)定INH和PZA的方法相對(duì)簡(jiǎn)單,本實(shí)驗(yàn)室建立了同時(shí)測(cè)定這兩種藥物血藥濃度的方法,現(xiàn)報(bào)道如下。

        1 儀器與試劑

        1.1 儀器 高效液相色譜系統(tǒng)(日本島津LC-10A),包括SCL-10AVP系統(tǒng)控制器、LC-10ADVP溶劑輸送泵、FCV-10ALVP混合器、DGU-14A脫氣機(jī)、SPD-10AVP紫外-可見(jiàn)檢測(cè)器、CTO-10ASVP柱溫箱、CLASS-VP6色譜工作站;渦旋儀(大龍興利);分析天平(FB224,上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司);酸度計(jì)(PHS-3C,上海雷磁);高速離心機(jī)(TG-1650,上海盧湘儀);艾本德微量移液器(Eppendor,德國(guó))。

        1.2 試劑 INH對(duì)照品(批號(hào):100578-200401、中國(guó)藥品生物制品檢定所);PZA對(duì)照品(批號(hào):100178-200403,中國(guó)藥品生物制品檢定所);甲醇、乙腈(Merck公司,德國(guó))均為色譜純;磷酸二氫鉀、三乙胺(國(guó)藥集團(tuán),中國(guó))均為分析純。

        2 方法和結(jié)果

        2.1 色譜條件 色譜柱:CLC-ODS(島津,日本,6 mm×150 mm);柱溫:37 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng):268 nm;流動(dòng)相:0.05 mmol/L磷酸二氫鉀(三乙胺調(diào)pH=5.6)∶乙腈=96∶4;流速:1 mL/min。

        2.2 樣品前處理 精密吸取血清300 μL,置于離心管中,加入700 μL甲醇,放置于渦旋混合儀上混合5 min,以13 000 r/min離心10 min,取上清液20 μL進(jìn)樣。

        2.3 方法特異性 按“2.2”項(xiàng)下方法,處理人空白血漿、對(duì)照品溶液+人空白血漿及同時(shí)服用INH和PZA的患者血漿。結(jié)果INH和PZA的保留時(shí)間分別為8.283 min和11.025 min,兩者峰形良好,與雜質(zhì)峰分離完全。色譜圖見(jiàn)圖1。

        圖1 色譜圖

        2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線 取INH和PZA標(biāo)準(zhǔn)液加入空白血漿,使血漿中INH和PZA濃度為0.3、0.6、1.2、2.4、4.8、9.6、19.2 mg/L。按“2.2”項(xiàng)下操作,同法處理血漿。以峰高外標(biāo)法定量,以濃度對(duì)峰面積作直線回歸,最低檢測(cè)濃度為0.3 mg/L,見(jiàn)表1。

        表1 INH和PZA標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性關(guān)系結(jié)果(n=6)

        2.5 回收率 配制低、中、高濃度(1、5、15 mg/L)的含INH和PZA的血漿樣品,每一濃度做平行管3份,按“2.2”項(xiàng)下方法操作進(jìn)樣,重復(fù)進(jìn)樣6次,記錄峰面積,按回歸方程計(jì)算濃度,與標(biāo)準(zhǔn)濃度比較得回收率,結(jié)果符合要求,見(jiàn)表2。

        表2 加樣回收率測(cè)定結(jié)果(n=6)

        2.6 精密度 配制低、中、高濃度(1、5、15 mg/L)的含INH和PZA的血漿樣品各6份,每一濃度做平行管3份,按“2.2”項(xiàng)下方法操作進(jìn)樣,分別于同日和3 d內(nèi)測(cè)定,計(jì)算日內(nèi)、日間RSD。精密度符合要求,結(jié)果見(jiàn)表3。

        表3 日內(nèi)、日間精密度計(jì)算結(jié)果(n=6)

        2.7 穩(wěn)定性 配制低、中、高濃度(1、5、15 mg/L)的含INH和PZA的血漿樣品,每一濃度做平行管3份,于室溫(20~30 ℃)放置0、4、8 h后,測(cè)定血漿樣品濃度,每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定6次;再取高、中、低濃度的INH和PZA的血漿樣品,于-20 ℃放置7、14 d后,測(cè)定血漿樣品濃度,每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定6次。結(jié)果表明,樣本在室溫8 h、反復(fù)凍融3次和在-20 ℃放置14 d的條件下保持穩(wěn)定。

        3 討論

        3.1 樣品前處理 通過(guò)固相萃取、液-液萃取、吹干復(fù)溶等樣品前處理方法的比較,最后選擇甲醇沉淀后直接進(jìn)樣的方法,該方法較固相萃取法成本大大降低,同時(shí)具有較高的回收率,而采取吹干復(fù)溶法雖然可以提高檢測(cè)靈敏度,但其耗時(shí)且費(fèi)用較高,不利于臨床廣泛開(kāi)展。在比較甲醇和乙腈沉淀蛋白的效果后,發(fā)現(xiàn)乙腈雖在1∶1用量時(shí)具有很好的沉淀效果,但由于流動(dòng)相中使用乙腈,進(jìn)樣時(shí)會(huì)造成色譜圖形變化,產(chǎn)生拖尾、偏峰。

        3.2 流動(dòng)相選擇 本實(shí)驗(yàn)室在測(cè)定單組分異煙肼時(shí)使用0.05 mmol/L磷酸二氫鉀(三乙胺調(diào)pH=5.6)∶乙腈=98∶2[6-7],該比例可以滿足同時(shí)測(cè)定INH和PZA,但測(cè)定時(shí)間超過(guò)15 min,通過(guò)多次嘗試后發(fā)現(xiàn),將磷酸二氫鉀和乙腈比例調(diào)整至96∶4時(shí),既可以避免血漿中雜質(zhì)峰干擾,又能將吡嗪酰胺的出峰時(shí)間前移約4 min,節(jié)約測(cè)定時(shí)間。

        3.3 檢測(cè)方法評(píng)價(jià) 該方法相較于單次測(cè)定每種抗結(jié)核藥的血藥濃度,可以節(jié)約1/2的成本和時(shí)間,同時(shí)具有很好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性,通過(guò)與單獨(dú)測(cè)定相同樣本INH和PZA的血藥濃度比較,該方法結(jié)果可靠,可以用于臨床樣本檢測(cè)。

        參考文獻(xiàn):

        [1] World Health Organization.Global tuberculosis control:WHO report 2010.WHO/HTM/TB/2010.7.Geneva:WHO,2010.

        [2] Stop TB Partnership.Global MDR-TB&XDR-TB response plan.2007-2008[M].Geneva:World Health Organization,2007:19.

        [3] 全國(guó)結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查技術(shù)指導(dǎo)組,全國(guó)結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查辦公室.2010年全國(guó)肺結(jié)核患病率現(xiàn)況調(diào)查[J].中華結(jié)核和呼吸雜志,2012,35(9):665-669.

        [4] 田洪英,王洪星,姚明.抗結(jié)核藥血藥濃度監(jiān)測(cè)及臨床療效與安全性分析[J].中國(guó)藥房,2012,23(26):92-94.

        [5] Saukkonen JJ,Cohn DL,Jasmer RM,et al.An official ATS statement:hepatotoxicity of antituberculosis therapy[J].Am J Respir Crit Care Med,2006,174(8):935-952.

        [6] 許亦鳴,陳冰,王潔,等.高效液相色譜法測(cè)定人血漿中異煙肼及乙酰異煙肼濃度[J].中國(guó)藥房,2005,16(13):41-43.

        [7] 楊書(shū)華,王潔,朱文玉,等.難治性結(jié)核性胸腔積液中異煙肼濃度的檢測(cè)和對(duì)比[J].臨床肺科雜志,2013,18(3):54-55.

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