陳肖肖，高業(yè)田，吳洪喜 ，王召根，王瑤華，周朝生，胡 園

(1.華東理工大學(xué)，上海 200237;2.浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所，溫州 325005;3.上海海洋大學(xué)，上海 201306;4.浙江省近岸水域生物資源開發(fā)與保護(hù)重點(diǎn)實驗室，溫州 325005)

消化酶是由消化腺和消化系統(tǒng)分泌的一類水解酶，主要分為淀粉酶、脂肪酶和胃蛋白酶等幾大類，消化酶能將食物分解成可吸收的小分子物質(zhì)，為機(jī)體提供所需的營養(yǎng)和能量，消化酶的活性變化能及時反映出生物體對消化生理調(diào)節(jié)和對環(huán)境適應(yīng)的響應(yīng)。已證實外界多種因素能對消化酶活性產(chǎn)生影響［1-6］，其中重金屬離子就是主要因素之一［7-9］。泥蚶(Tegillarca granosa)是一種棲息于沿海灘涂的雙殼貝類，因其營底棲生活，且移動性差，極易受重金屬污染的水域和底質(zhì)的影響，但迄今尚未見到有關(guān)重金屬對泥蚶消化酶活性影響的詳細(xì)研究報道。

本文總結(jié)和分析了重金屬Cd2+和Cu2+及其組合對泥蚶3種消化酶活性的影響結(jié)果，探討重金屬Cd2+和Cu2+對泥蚶的毒害作用機(jī)制，為重金屬的潛在生態(tài)風(fēng)險評價提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

FLUKO F6/10超細(xì)勻漿器(上海弗魯克流體機(jī)械制造有限公司);DK-600電熱恒溫水槽(上海精宏實驗設(shè)備有限公司);WFZ UV-2000紫外可見分光光度計(尤尼克上海儀器有限公司);Anke TGL-16G-A低溫離心機(jī)(上海安寧科學(xué)儀器廠);LDZ4-0.8A離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠);1.5mL和5mL離心管、濾紙、培養(yǎng)皿(江蘇志達(dá)實驗器材商城);淀粉酶、脂肪酶、胃蛋白酶試劑盒、考馬斯亮藍(lán)總蛋白試劑盒(南京建成生物工程研究所);CdCl2·2.5H2O、冰乙酸(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);CuSO4·5H2O(分析純，上海新寶精細(xì)化工);NaCl(分析純，浙江中星化工試劑廠)。

1.2 實驗動物及其暫養(yǎng)

實驗?zāi)囹烙?012年5月采自浙江樂清灣養(yǎng)殖區(qū)，為2齡個體，從中隨機(jī)取得20個，用游標(biāo)卡尺和電子天平測量和稱重，殼長(28.22±2.29)mm，體重(8.14±1.95)g。實驗前，將泥蚶暫養(yǎng)于盛有40 L海水、規(guī)格為48 cm×36 cm×30 cm的塑料箱中。實驗海水取自樂清灣清江海區(qū)，經(jīng)24 h以上沉淀和沙濾后使用。水溫(20.51±1.91)℃，pH 值8.09±0.58，鹽度20.33±0.58，油類、總汞、銅、鋅、鉛、鎘、鉻等指標(biāo)符合《漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》(GB 11607)。暫養(yǎng)期間24h連續(xù)充氧，每天上午換新鮮海水1次，換水量為100%，早晚各投喂扁藻(Platymonas subcordiformis)1次，投喂后保持水體中扁藻密度約為5×104細(xì)胞/mL。

1.3 重金屬Cd2+和Cu2+母液的配制

Cd2+母液的配制稱取國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)的分析純級氯化鎘(CdCl2·2.5H2O)1.016 g，溶于500 mL去離子水，配成濃度為1 g/L的Cd2+母液。

Cu2+母液的配制稱取上海新寶精細(xì)化工生產(chǎn)的分析純級硫酸銅(CuSO4·5H2O)1.950g，溶于500 mL去離子水，配成濃度為1 g/L的Cu2+母液。

1.4 實驗設(shè)計

Cd2+和Cu2+離子濃度分別按《漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》(GB 11607)最高限量值的1、2、5、10倍設(shè)置，重金屬組合濃度為Cd2+、Cu2+相對應(yīng)濃度的疊加，再設(shè)1個空白對照(表1)。每個實驗組設(shè)置3個平行。實驗在若干個盛有40 L海水、規(guī)格為48 cm×36 cm×30 cm的塑料箱中進(jìn)行，實驗海水用配制好的重金屬母液調(diào)節(jié)到表1中設(shè)定的濃度，然后向每個塑料箱中放養(yǎng)已暫養(yǎng)1周的健康泥蚶40個。實驗期間管理同暫養(yǎng)期，每次換水后分別加入含有相應(yīng)重金屬離子濃度的新鮮海水，以保持水體中重金屬離子濃度的恒定。整個實驗歷時30d。

表1 重金屬脅迫實驗設(shè)計Table 1 The design of heavy metal stress experiment

1.5 樣品制備和酶活性的測定

實驗開始時及實驗后第2天、5天、10天、15天、30天各取樣1次，每次每箱隨機(jī)取5只實驗?zāi)囹?。將其置于冰盤上盡快解剖，取出胃和消化盲囊，用預(yù)冷的0.86%生理鹽水清洗2次，除去血液，用濾紙拭干后稱取0.35 g置于5 mL干凈的離心管中。加入1.4 mL 0.86% 生理鹽水(比例為1 g樣品/5mL 0.86%生理鹽水)，用眼科小剪刀將其剪碎，然后用超細(xì)勻漿器在15000 r/min速度下勻漿3—5 min，制成20%的組織勻漿液，以上步驟均在冰浴中進(jìn)行。再將勻漿液置于低溫離心機(jī)，2000 r/min速度下離心15 min，取上清液測定有關(guān)數(shù)值。

樣品淀粉酶、胃蛋白酶和脂肪酶活性以及總蛋白含量的測定步驟與方法嚴(yán)格按照南京建成生物工程研究所試劑盒上的說明書進(jìn)行。

淀粉酶活性單位 每毫克的組織蛋白在37℃與底物作用30min，水解10 mg淀粉為一個淀粉酶活力單位(U/mg蛋白)。

胃蛋白酶活性單位 每毫克組織蛋白在37℃條件下每分鐘分解蛋白生成1 μg氨基酸相當(dāng)于1個酶活力單位(U/mg蛋白)。

脂肪酶活性單位 每毫克蛋白在37℃條件下與底物作用1min，每消耗1 μmol底物為一個酶活力單位(U/mg蛋白)。

1.6 數(shù)據(jù)處理及分析

采用SPSS 15.0軟件中的雙因素方差分析(Two-way ANOVA)和Tukey檢驗處理濃度和時間對消化酶活性影響的相應(yīng)數(shù)據(jù)，顯著性水平設(shè)置為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 Cd2+、Cu2+及其組合脅迫下泥蚶淀粉酶活性的變化

實驗結(jié)果表明:與空白對照組相比，Cd2+對泥蚶淀粉酶活性的影響，0.005 mg/L濃度在整個實驗期間均起著誘導(dǎo)作用，0.01 mg/L濃度在實驗開始后約13 d內(nèi)也起著不同程度的誘導(dǎo)作用;較高濃度組在實驗開始后第2天表現(xiàn)出顯著的抑制作用，隨著脅迫時間的延長，淀粉酶的活性雖有所恢復(fù)，但至實驗結(jié)束時仍處于抑制狀況(圖1)。Cu2+對泥蚶淀粉酶活性的影響，0.01、0.02 mg/L等低濃度組在實驗開始后的4 d內(nèi)起誘導(dǎo)作用，然后轉(zhuǎn)變成與高濃度組一樣，表現(xiàn)出顯著的抑制作用(圖2)。Cd2++Cu2+組合對泥蚶淀粉酶活性的影響，(0.005+0.01)mg/L和(0.01+0.02)mg/L濃度組所起的作用與低濃度Cu2+所起的作用基本相似，實驗前期起誘導(dǎo)作用，實驗后期轉(zhuǎn)變?yōu)橐种谱饔?，但起誘導(dǎo)作用的時間較長，持續(xù)約7—12 d，高濃度的Cd2++Cu2+組合從實驗一開始就表現(xiàn)出顯著的抑制作用，且劑量效應(yīng)明顯，隨著脅迫時間的延長，對酶的活性影響增大(圖3)。

圖1 Cd2+脅迫下泥蚶淀粉酶活性的變化Fig.1 Time course changes of amylase activity of Tegillarca granosa exposed to cadmium

圖2 Cu2+脅迫下泥蚶淀粉酶活性的變化Fig.2 Time course changes of amylase activity of Tegillarca granosa exposed to copper

圖3 Cd2++Cu2+組合脅迫下泥蚶淀粉酶活性的變化Fig.3 Time course changes of amylase activity of Tegillarca granosa exposed to cadmium and copper

比較實驗第30天淀粉酶活性值大小，發(fā)現(xiàn)受單一離子脅迫時，在相同的濃度下，Cu2+組泥蚶明顯小于Cd2+組泥蚶。Cd2++Cu2+組合的泥蚶介于相對應(yīng)濃度的單一Cd2+組泥蚶和Cu2+組泥蚶之間。

Two-way ANOVA分析表明，重金屬 Cd2+、Cu2+和Cd2++Cu2+組合的濃度、脅迫時間對泥蚶淀粉酶活性均有顯著性影響，時間與濃度的交互作用(Cd2+組除外)也顯著地影響著淀粉酶的活性(P＜0.05)(表2)。

2.2 Cd2+、Cu2+及其組合脅迫下泥蚶脂肪酶活性的變化

實驗結(jié)果表明:與空白對照組相比，Cd2+、Cu2+對泥蚶脂肪酶活性的影響，除 Cd2++Cu2+組合的高濃度(0.05+0.1)mg/L組外，其它濃度脅迫下的泥蚶脂肪酶活性均呈先迅速升高后緩慢降低的變化。在Cd2+的脅迫下，泥蚶脂肪酶活性在實驗的第5天達(dá)到峰值(圖4)。Cu2+的脅迫對泥蚶脂肪酶活性的影響更強(qiáng)烈，在實驗第2天就達(dá)高峰，特別是濃度為0.01 mg/L的Cu2+組，在實驗的第2天，泥蚶脂肪酶活性上升到空白對照組的3倍(圖5)。Cd2++Cu2+組合，除最高濃度(0.05+0.1)mg/L外，其余濃度對泥蚶脂肪酶活性的影響，前期起誘導(dǎo)作用，且在實驗開始后的2—5 d內(nèi)達(dá)到峰值，實驗后期起微抑制或微誘導(dǎo)作用(圖6)。

比較實驗第30天脂肪酶活性，發(fā)現(xiàn)受單一離子脅迫時，在相同的濃度下，Cu2+組泥蚶脂肪酶活性值明顯低于Cd2+組泥蚶。Cd2++Cu2+組合的泥蚶脂肪酶活性值明顯低于相對應(yīng)濃度的單一Cd2+組泥蚶或Cu2+組泥蚶。

Two-way ANOVA分析表明:在Cd2+、Cu2+和Cd2++Cu2+脅迫過程中，濃度和時間對泥蚶脂肪酶活性影響均有顯著性差異，時間與濃度的交互作用也顯著地影響著脂肪酶的活性(P＜0.01)(表3)。

表2 重金屬脅迫下泥蚶淀粉酶活性的雙因素方差分析結(jié)果Table 2 The Two-way ANOVA result of amylase activity of Tegillarca granosa exposed to heavy metal

圖4 Cd2+脅迫下泥蚶脂肪酶活性的變化Fig.4 Time course changes of lipase activity of Tegillarca granosa exposed to cadmium

圖5 Cu2+脅迫下泥蚶脂肪酶活性的變化Fig.5 Time course changes of lipase activity of Tegillarca granosa exposed to copper

圖6 Cd2++Cu2+組合脅迫下泥蚶脂肪酶活性的變化Fig.6 Time course changes of lipase activity of Tegillarca granosa exposed to cadmium and copper

2.3 Cd2+、Cu2+及其組合脅迫下泥蚶蛋白酶活性的變化

實驗結(jié)果表明:與空白對照組相比，Cd2+、Cu2+的脅迫對泥蚶胃蛋白酶活性影響復(fù)雜。在Cd2+的脅迫下，實驗前期，泥蚶胃蛋白酶活性受到誘導(dǎo)，且酶的活性呈現(xiàn)升高-降低-再升高-再降低的變化，在實驗的第2天和第15天出現(xiàn)2個活性較強(qiáng)的峰，而實驗后期，0.025、0.05 mg/L等較高濃度脅迫對泥蚶蛋白酶活性影響開始轉(zhuǎn)化為抑制作用(圖7)。在Cu2+的脅迫下，當(dāng)濃度為0.01、0.02 mg/L時，泥蚶胃蛋白酶活性在實驗的前25d呈先升高后降低的變化，此后，基本不受影響;當(dāng)濃度為0.05 mg/L和0.1 mg/L時，分別在實驗的4 d、9 d內(nèi)對泥蚶的蛋白酶的活性起誘導(dǎo)作用，然后轉(zhuǎn)化為抑制作用(圖8)。Cd2++Cu2+組合對泥蚶胃蛋白酶活性的影響更為復(fù)雜，在低濃度組合(0.005+0.01)mg/L和(0.01+0.02)mg/L脅迫下，泥蚶胃蛋白酶活性在實驗前期受到誘導(dǎo)，都在實驗的第2天和10天各出現(xiàn)1個峰(P＜0.05)，表現(xiàn)為升高—降低—升高—降低的變化，然后約在實驗的第13天開始受到抑制。而在較高濃度組合(0.025+0.05)mg/L脅迫下，酶活在實驗第5天時出現(xiàn)一個顯著性誘導(dǎo)的峰值(P＜0.05)，最高濃度組合(0.05+0.1)mg/L對泥蚶胃蛋白酶的活性一直呈抑制作用(圖9)。

比較實驗第30天泥蚶胃蛋白酶活性值，發(fā)現(xiàn)受單一離子脅迫時，在相同的濃度下，Cu2+組明顯低于Cd2+組。Cd2++Cu2+組合明顯低于相對應(yīng)濃度的單一Cd2+組或Cu2+組值。

表3 重金屬脅迫下泥蚶脂肪酶活性的雙因素方差分析結(jié)果Table 3 The Two-way ANOVA result of lipase activity of Tegillarca granosa exposed to heavy metal

圖7 Cd2+脅迫下泥蚶胃蛋白酶活性的變化Fig.7 Time course changes of pepsin activity of Tegillarca granosa exposed to cadmium

圖8 Cu2+脅迫下泥蚶胃蛋白酶活性的變化Fig.8 Time course changes of pepsin activity of Tegillarca granosa exposed to copper

圖9 Cd2++Cu2+組合脅迫下泥蚶胃蛋白酶活性的變化Fig.9 Time course changes of pepsin activity of Tegillarca granosa exposed to cadmium and copper

Two-way ANOVA分析表明:在 Cd2+、Cu2+或 Cd2++Cu2+的脅迫過程中，濃度和時間對泥蚶蛋白酶活性均有顯著性差異，時間與濃度的交互作用(Cu2+組除外)也極顯著地影響著蛋白酶的活性(P＜0.01)(表4)。

3 討論

3.1 重金屬離子脅迫對底棲貝類消化酶活性的影響

本實驗結(jié)果表明，Cd2+對泥蚶的淀粉酶活性影響，低濃度有誘導(dǎo)作用，高濃度有抑制作用;脂肪酶活性前期受到誘導(dǎo)，后期逐漸減弱;胃蛋白酶活性基本處于誘導(dǎo)狀態(tài)，且呈升高—降低—再升高—再降低的變化規(guī)律。這與賴廷和［10］報道在Cd2+的脅迫下，紅樹蜆的淀粉酶基本表現(xiàn)為抑制作用;脂肪酶前期呈顯著誘導(dǎo)，隨著脅迫時間延長酶活性下降;蛋白酶的影響規(guī)律性不明顯的研究結(jié)果不完全一致。其實，賴廷和實驗的重金屬Cd2+濃度設(shè)定范圍為0.125—4.00 mg/L，其最低濃度(0.125 mg/L)比本實驗的最高濃度(0.05 mg/L)還高，二者的Cd2+濃度范圍不在同一個區(qū)間，所以二者的結(jié)果也無可比性，但可以認(rèn)為，本實驗是賴廷和試驗較低濃度范圍的延伸，是在較低濃度條件下Cd2+對底棲貝類消化酶的影響研究的補(bǔ)充。至于為何賴廷和的實驗Cd2+對蛋白酶的影響效應(yīng)規(guī)律性不明顯，筆者認(rèn)為，這可能是由于賴廷和實驗設(shè)置的Cd2+濃度過高，對生物體的消化酶分泌系統(tǒng)的基本活動已經(jīng)造成損害，甚至影響正常生理功能。

表4 重金屬脅迫下泥蚶胃蛋白酶活性的雙因素方差分析結(jié)果Table 4 The Two-way ANOVA result of pepsin activity of Tegillarca granosa exposed to heavy metal

吳眾望［8］做過重金屬 Cu2+(濃度為0.128、1.28、12.8、128、1280 mg/L)對縊蟶消化酶的脅迫實驗，發(fā)現(xiàn)濃度為0.128、1.28 mg/L的Cu2+對縊蟶的淀粉酶活性有顯著的促進(jìn)作用，其余濃度(12.8、128、1280mg/L)的Cu2+對縊蟶的淀粉酶活性的影響不顯著;對縊蟶蛋白酶活性影響也不顯著。估計這種結(jié)果也是實驗設(shè)計的重金屬濃度太高，超出了實驗生物消化酶系統(tǒng)能夠正常承受的脅迫范圍。

與ZHEN［11］等發(fā)現(xiàn)，消化酶活性與重金屬之間存在明顯的劑量效應(yīng)不同，本實驗前期的劑量效應(yīng)規(guī)律性不明顯，直到后期，特別是第30天測得的酶活值與重金屬濃度表現(xiàn)出負(fù)相關(guān)性。究其原因，剛開始實驗時，由于金屬硫蛋白［12］等解毒系統(tǒng)的存在，致使泥蚶3種消化酶活性有不同程度的誘導(dǎo)或修復(fù)作用，表現(xiàn)出某些實驗組別(如Cd2+脅迫下的淀粉酶)劑量效應(yīng)不明顯;隨時間的延長和泥蚶體內(nèi)重金屬的大量富集，重金屬對酶活的影響，呈明顯的劑量效應(yīng)?？梢?，泥蚶3種消化酶活性變化可以靈敏反映重金屬對泥蚶生理的脅迫程度，還可作為重金屬生態(tài)風(fēng)險的評價指標(biāo)。

3.2 組合金屬離子對底棲貝類消化酶的毒性

比較相同濃度下單一的Cd2+或Cu2+對泥蚶3種消化酶活性影響，發(fā)現(xiàn)實驗結(jié)束時(第30天)，泥蚶淀粉酶、脂肪酶和胃蛋白酶活性值Cu2+組均明顯低于Cd2+組，說明對于泥蚶體內(nèi)這3種消化酶活性而言，Cu2+對酶活的影響更顯著，毒性強(qiáng)于Cd2+，這與其他貝類急性毒性實驗中［13-14］得到的Cu2+的毒性要大于Cd2+的結(jié)果相一致。比較組合Cd2++Cu2+與單一Cd2+或Cu2+，在組合Cd2++Cu2+的脅迫下，實驗第30天泥蚶的脂肪酶和胃蛋白酶活性均明顯低于任一單獨(dú)重金屬的脅迫，說明Cd2+和Cu2+對該2種泥蚶酶活性具有協(xié)同毒性作用。但對淀粉酶來說，2種重金屬的協(xié)同毒性作用對其活性的影響就沒有那么明顯，淀粉酶活性值介于單一的Cd2+和Cu2+作用下的活性值之間，相對毒性也介于兩者之間。

3.3 重金屬離子脅迫對生物消化酶影響機(jī)理的探討

當(dāng)重金屬Cd2+或Cu2+進(jìn)入泥蚶體內(nèi)時，將引起泥蚶機(jī)體一系列的生理防御反應(yīng)，少量重金屬離子可能通過操縱基因作用誘導(dǎo)消化酶蛋白合成［15］，或者作為酶結(jié)構(gòu)的輔基增強(qiáng)酶活性中心與底物間的配位結(jié)合，維持酶分子及其活性中心的特定結(jié)構(gòu)，通過改變酶蛋白的表面電荷和酶催化反應(yīng)的平衡［16］從而提高消化酶的活性，如實驗前期低濃度組的Cd2+、Cu2+和Cd2++Cu2+對泥蚶淀粉酶和脂肪酶活性的誘導(dǎo)，增強(qiáng)泥蚶的消化吸收利用能力用于補(bǔ)償因應(yīng)對不良環(huán)境所需的能量消耗，滿足其代謝的能量需求［17］。

本實驗結(jié)果表明，在高濃度0.025、0.05 mg/L Cd2+組、各濃度Cu2+組和Cd2++Cu2+組合的脅迫下，泥蚶淀粉酶活性在實驗后期均受到抑制，而在單一和組合重金屬的脅迫下，隨時間延長對泥蚶脂肪酶活性的誘導(dǎo)效應(yīng)不斷減弱，逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)橐种谱饔?，并且濃度越高，轉(zhuǎn)變的時間越早，酶活受到的抑制作用越強(qiáng)。同樣，胃蛋白酶活性在實驗后期基本上也呈抑制狀態(tài)?？傊?，泥蚶長時間在重金屬脅迫下，3種消化酶活性都會受到不同程度的抑制，泥蚶通過這種方式減少進(jìn)食量，降低新陳代謝速率［18］以減輕重金屬對機(jī)體的損傷程度。Cu2+作為生物體的一種必需微量元素，與Cd2+不同，只有在生物體內(nèi)累積過多時才會產(chǎn)生致毒效應(yīng)。一般認(rèn)為致毒反應(yīng)與生物體內(nèi)金屬硫蛋白(Metallothionein，簡稱MT)的合成有關(guān)，金屬硫蛋白可以螯合和貯存多余的銅，或與Cu2+形成結(jié)合物來維持細(xì)胞內(nèi)Cu2+的濃度，以減輕其毒性。但是當(dāng)泥蚶體內(nèi)累積的Cu2+濃度過高時，MT結(jié)合Cu2+能力將達(dá)到飽和，而溢出的Cu2+作用到其他生物大分子，如酶上，即引起酶活性的降低。對于Cd2+來說，一種方式是通過取代酶蛋白中其他金屬離子而導(dǎo)致酶活性的失去，已有研究表明淀粉酶是Ca2+的依賴性酶，低濃度Cd2+對酶活性有激活作用，而高濃度Cd2+可能通過占據(jù)Ca2+的結(jié)合位點(diǎn)，且與結(jié)合位點(diǎn)外的氨基酸殘基結(jié)合使酶的構(gòu)象改變，從而抑制酶的活性［19］。Cd2+還可以取代機(jī)體中含鋅酶中的鋅，與鋅指蛋白結(jié)合，使其失去功能［20］。此外，還可結(jié)合酶分子中的咪唑基、巰基、羥基、氨基、肽基等功能基團(tuán)從而達(dá)到抑制酶活的效果［21］。

重金屬離子Cd2+和Cu2+可能通過上述機(jī)制來影響消化酶的活性，但每種消化酶的作用機(jī)制也不完全相同。環(huán)境化學(xué)物的聯(lián)合毒性作用類型主要有相加、協(xié)同、增強(qiáng)、拮抗和獨(dú)立作用等類型，且目前未見Cd2+和Cu2+聯(lián)合作用機(jī)理的研究報道，混合重金屬之間又相互聯(lián)系、相互影響的情況比較復(fù)雜，具體機(jī)制仍需進(jìn)一步的探討。

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