詹 璐 邵征洋 王孫堯 林 隆 許先科 連俊蘭 李志敏 賀 悅

杭州市紅十字會(huì)醫(yī)院兒科 杭州 310003

嬰幼兒呼吸道合胞病毒性毛細(xì)支氣管炎血清ECPmRNA檢測(cè)臨床意義

詹 璐 邵征洋 王孫堯 林 隆 許先科 連俊蘭 李志敏 賀 悅

杭州市紅十字會(huì)醫(yī)院兒科 杭州 310003

毛細(xì)支氣管炎 兒童 呼吸道合胞病毒 嗜酸細(xì)胞趨化蛋白 ECP嗜酸性粒細(xì)胞陽(yáng)離子蛋白（ECP）是嗜酸性粒細(xì)胞（Eos）釋放的毒性顆粒蛋白，ECPmRNA通過(guò)表達(dá)進(jìn)一步釋放ECP，在炎癥性和過(guò)敏性疾病中均發(fā)揮著重要作用，但對(duì)ECPmRNA對(duì)在呼吸道合胞病毒（RSV）感染的毛細(xì)支氣管炎患兒中血清學(xué)含量變化研究較少[1-2]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定呼吸道合胞病毒性毛細(xì)支氣管炎患兒血清ECPmRNA含量，探討其對(duì)呼吸道合胞病毒感染的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2009年6月—2011年3月本院兒科住院診治的毛細(xì)支氣管炎患兒63例，其中男35例，女28例，年齡（8.8±0.2）個(gè)月。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：①初次發(fā)病。②診斷符合《諸福棠實(shí)用兒科學(xué)》第7版有關(guān)毛細(xì)支氣管炎診斷標(biāo)準(zhǔn)。③除外先天性心臟病、結(jié)核感染及支氣管異物等疾病。④經(jīng)抗堿性磷酸酶橋酶標(biāo)法（APAAP）檢測(cè)鼻咽部分泌物確診為RSV感染。⑤無(wú)個(gè)人和家庭過(guò)敏史（哮喘、過(guò)敏性皮炎、鼻炎）。⑥入院前2周未使用糖皮質(zhì)激素。參照Bearman等[3]的毛細(xì)支氣管炎臨床癥候評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，將63例分為輕癥和重癥兩組。輕癥組（≤6分）19例，男11例，女8例，月齡3～24個(gè)月，平均（8.6±0.2）個(gè)月。重癥組（7～12分）44例，男24例，女20例，月齡4～24個(gè)月，平均（9.2±0.1）個(gè)月。另隨機(jī)選取同期體檢健康的嬰幼兒21名作為對(duì)照組，其中男10名，女11名，月齡4～24個(gè)月，平均（8.5±0.2）個(gè)月。對(duì)照組與感染組年齡、性別等差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本研究為成組設(shè)計(jì)臨床研究，實(shí)施前所有家長(zhǎng)知情同意，并得到醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方 法

1.2.1 儀器與試劑 儀器Bio-tek酶標(biāo)儀。RNA提取盒購(gòu)自上海華舜公司；RT-PCR一步法試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司；PCR引物由上海太陽(yáng)生物科技公司設(shè)計(jì)并合成。

1.2.2 標(biāo)本收集與測(cè)定 對(duì)所有納入研究的患兒，在清晨空腹安靜狀態(tài)下采取靜脈血3mL，分離血清于無(wú)RNA酶EP管（干冰操作），置于-70℃冰箱中。RNA提取按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，目的基因ECP引物如下：上游：5′GAAAGATGGGGCTGTTGAGT3′，下游5′CTTCTCACCACGAGGTAGCG3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為135bp；內(nèi)參基因β-肌動(dòng)蛋白引物：上游5′ATTCCTATGTGGGCGAOGAG3′，下游5′AGAGGC?GTACAGGGATAGCA3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為284bp。按說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成互補(bǔ)DNA（cDNA），以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。RT-PCR反應(yīng)條件[4]如下：cDNA合成和預(yù)變性：50℃逆轉(zhuǎn)錄30min，94℃ 2min進(jìn)行1次循環(huán)；PCR擴(kuò)增: 95℃變性，1min，60℃退火1min，72℃延伸1min，共32個(gè)循環(huán)，最后以72℃延伸10min。取5μLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠中，120V電泳30min凝膠成像，應(yīng)用圖像分析軟件分析各條帶平均灰度值，結(jié)果以目的基因與β-肌動(dòng)蛋白CT比值表示。

2 結(jié)果

輕癥組、重癥組及對(duì)照組血清ECPmRNA表達(dá)量分別為0.4530±0.0562、0.5012±0.0373、0.3929± 0.0305；各毛支氣管炎患兒組血清ECPmRNA的表達(dá)量均明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；重癥組患兒血清ECPmRNA表達(dá)量高于輕癥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

感染組與對(duì)照組標(biāo)本RT－PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖顯示：在大約135bp和284bp位置，各電泳道均出現(xiàn)擴(kuò)增條帶，與ECP、β-actin預(yù)期擴(kuò)增的目的條帶位置一致。ECP和β-aFtin相應(yīng)于135bp和284bp位置。見(jiàn)圖1。

圖1 ECP mRNA電泳圖

3 討論

ECP是一種單鏈糖蛋白，呈強(qiáng)堿性，由嗜酸性粒細(xì)胞活化釋放，被認(rèn)為是嗜酸性粒細(xì)胞的特異性標(biāo)志。ECP反映了嗜酸性粒細(xì)胞的活化程度，具有強(qiáng)大的細(xì)胞毒性和神經(jīng)毒性，可引起肥大細(xì)胞釋放組胺，是造成氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性、誘發(fā)和加重喘息的重要物質(zhì)。毛細(xì)支氣管炎是嬰幼兒呼吸道感染的常見(jiàn)病，而RSV是毛細(xì)支氣管炎的主要病源，大約有80%的毛細(xì)支氣管炎由RSV[7]感染所致。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，嬰幼兒期患過(guò)RSV毛細(xì)支氣管炎患兒50%～70%可反復(fù)喘息，甚至發(fā)展成哮喘[2-6]。因此RSV毛細(xì)支氣管炎與以后發(fā)展成反應(yīng)性氣道疾病存在著密切關(guān)系。目前毛細(xì)支氣管炎后出現(xiàn)反復(fù)喘息發(fā)作以及毛細(xì)支氣管炎與哮喘之間的相關(guān)性已受到重視，通過(guò)采用候選基因的關(guān)聯(lián)分析法來(lái)尋求可能的RSV易感基因研究，獲得了大量天然免疫調(diào)節(jié)因子參與的證據(jù)[7]，其中很多研究就是關(guān)于ECP及嗜酸性粒細(xì)胞的。目前對(duì)于ECP與毛細(xì)支氣管炎關(guān)系研究較多，主要集中在對(duì)于毛細(xì)支氣管炎患兒鼻腔分泌物和血清液研究中，如Choi[8]及金可等[9]對(duì)毛細(xì)支氣管炎患兒急性期鼻咽腔分泌物進(jìn)行研究，研究表明鼻咽中ECP濃度明顯升高，并且隨病情好轉(zhuǎn)而顯著降低。既往研究[1]，毛細(xì)支氣管炎患兒急性期血清中ECP濃度未見(jiàn)明顯升高，并且隨病情的好轉(zhuǎn)無(wú)明顯改變。但這兩種實(shí)驗(yàn)對(duì)鼻部分泌物采樣要求高[9]，易受到污染。而血清ECP帶正電，呈弱堿性，不能通過(guò)血管內(nèi)皮進(jìn)入血循環(huán)或由血液進(jìn)入氣道，因此其血清未見(jiàn)陽(yáng)性。對(duì)于ECPmRNA目前研究較少，ECP通過(guò)ECPmRNA進(jìn)行表達(dá)，故通過(guò)ECP mRNA測(cè)定可以了解ECP的含量及在病理過(guò)程中的作用。本研究證實(shí)，血清ECPmRNA參與毛細(xì)支氣管炎炎癥過(guò)程，與病情密切相關(guān)，說(shuō)明毛細(xì)支氣管炎急性期有ECPmRNA分泌，嗜酸性粒細(xì)胞聚集并被激活，釋放出ECP導(dǎo)致氣道上皮細(xì)胞損傷，進(jìn)而增加氣道的過(guò)敏性炎癥，引發(fā)喘息。

本組結(jié)果顯示，血清ECPmRNA在重癥毛細(xì)支氣管炎表達(dá)高于輕癥毛細(xì)支氣管炎，提示癥狀越重其ECPmRNA含量越高，而健康兒童表達(dá)最低。ECP mRNA由嗜酸性粒細(xì)胞分泌，其對(duì)毛細(xì)支氣管炎診治有重要的臨床意義。

［1］吳榮熙，王國(guó)健，李孟榮，等.ECP和IL-4、IL-5與RSV毛細(xì)支氣管炎發(fā)病機(jī)制相關(guān)性研究［J］.中國(guó)實(shí)用兒科雜志，2001，16（5）：284-285.

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2012-07-12