陳筱凡 杭州市中醫(yī)院檢驗(yàn)科 杭州 310006

白花蛇舌草提取物體外抑制K562細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)研究

陳筱凡 杭州市中醫(yī)院檢驗(yàn)科 杭州 310006

目的：觀察白花蛇舌草提取物（HDE）體外對(duì)人白血病細(xì)胞株K562增殖的影響，探討HDE用于治療白血病的作用機(jī)制。方法：以白血病K562細(xì)胞株為靶細(xì)胞，觀察不同濃度的HDE對(duì)K562細(xì)胞增殖的影響，及胞內(nèi)線粒體跨膜電位（ΔΨm）的水平；檢測(cè)低濃度HDE處理前后胞內(nèi)Survivin、Bcl-2基因表達(dá)。結(jié)果：HDE（6.4mL/L）能明顯抑制K562細(xì)胞增殖，且與濃度呈正相關(guān)（P＜0.05或P＜0.01）。通過流式細(xì)胞術(shù)對(duì)碳氰化合物類親脂性熒光染料（JC-1）檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，HDE能使靶細(xì)胞內(nèi)ΔΨm降低，且與HDE處理濃度呈負(fù)相關(guān)；K562細(xì)胞經(jīng)低濃度HDE（3.2mL/L）處理3周后，Survivin、Bcl-2基因表達(dá)均低于未經(jīng)處理細(xì)胞的2.7倍和1.6倍。結(jié)論：HDE可能通過降低線粒體跨膜電位，抑制抗凋亡基因的表達(dá)，抑制K562白血病細(xì)胞增殖。

白花蛇舌草提取物 K562細(xì)胞 跨膜電位 凋亡基因

白花蛇舌草是我國(guó)民間治癌的有效中草藥，具有活血化瘀、清熱解毒、消腫止痛等功效，臨床上用于濕熱蘊(yùn)毒所致上呼吸道感染、闌尾炎、肺炎、扁桃體炎及術(shù)后感染[1]。近年研究顯示白花蛇舌草提取物（HDE）對(duì)白血病也有較好的療效[2-3]。筆者以K562細(xì)胞作為靶細(xì)胞，觀察HDE對(duì)白血病細(xì)胞線粒體跨膜電位等的影響，探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 白花蛇舌草提取物購(gòu)于通化振國(guó)藥業(yè)有限公司，批號(hào)091015。處理細(xì)胞時(shí)，用RP?MI1640（Gibco）配置成所需濃度的工作液（終濃度分別為：1.6mL/L、3.2mL/L、6.4mL/L、12.8mL/L和25.6mL/ L）。K562細(xì)胞株購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。用含10%小牛血清的RP?MI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，每2～3天傳代1次，然后取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 方 法

1.2.1 HDE對(duì)K562細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn) 用含10%小牛血清、1×105細(xì)胞/mL和不同濃度的HDE的培養(yǎng)體系共200μL，置于96孔板中，每個(gè)濃度作4個(gè)平行孔，以不加HDE作對(duì)照組。培養(yǎng)72h，在終止培養(yǎng)前4h加MTT（5g/L）20μL/孔，離心，每孔加150μL DMSO，振蕩，酶標(biāo)儀570nm處測(cè)吸光度（A570）。

1.2.2 線粒體跨膜電位（ΔΨm）水平檢測(cè) 不同濃度的HDE分別處理K562細(xì)胞24、48、72h后，PBS洗滌2次，調(diào)整細(xì)胞濃度（1×106/mL），加入碳氰化合物類親脂性熒光染料（JC-1）5μL（1mg/mL），混勻，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中，避光孵育30min，再PBS洗滌2次后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，熒光通道FL1（520nm，綠色）和FL2（590nm，紅色）與熒光強(qiáng)度，計(jì)算FL1與FL2的比值，表示線粒體跨膜電位水平變化。

1.2.3 HDE處理前后Survivin、Bcl-2基因表達(dá) ①總RNA提取：收集足夠的細(xì)胞按照Trizol一步法操作。分裝-80℃保存，備用。②半定量RT-PCR兩基因擴(kuò)增：cDNA合成：20μL逆轉(zhuǎn)錄體系含有5×Bfr、Oligo dT、dNTP、RNasin、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶。PCR擴(kuò)增：體系包括10×PCR反應(yīng)緩沖液、MgCl2、10mM dNTP、Survivin或Bcl-2引物、β-actin、Taqase、RT產(chǎn)物、DEPC水。94℃變性55Sec，55℃退火1min，72℃延伸1min，33個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。③產(chǎn)物電泳：取產(chǎn)物10μL，瓊脂糖凝膠（1.2%），電泳3h，進(jìn)行觀察、拍照并用凝膠圖像分析系統(tǒng)分析，保存。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。見表1。

表1 PCR擴(kuò)增各引物序列

2 結(jié) 果

2.1 HDE抑制K562細(xì)胞增殖作用 MTT結(jié)果顯示，1.6mL/L、3.2mL/L濃度的HDE對(duì)K562細(xì)胞幾乎無抑制作用，與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），中濃度以上HDE（6.4mL/L）可抑制K562細(xì)胞增殖，并與濃度相關(guān)，見表2。

2.2 HDE處理前后線粒體跨膜電位（ΔΨm）水平變化 HDE處理24h后，細(xì)胞線粒體跨膜電位有所下降。48h后細(xì)胞內(nèi)線粒體跨膜電位下降的百分率顯著增加，F(xiàn)L1/FL2比值明顯增大。細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)至72h后，胞內(nèi)線粒體跨膜電位下降無明顯變化，見圖1～2。

2.3 HDE處理前后Survivin、Bcl-2抗凋亡基因表達(dá)結(jié)果 半定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示HDE（3.2mL/ L）處理2周前后，Survivin、Bcl-2表達(dá)變化不明顯；處理至3周左右時(shí)，Survivin、Bcl-2表達(dá)都明顯低于未經(jīng)處理過細(xì)胞的2.7倍和1.6倍，見圖3。

表2 不同濃度HDE對(duì)K562細(xì)胞增殖抑制作用（±s）

表2 不同濃度HDE對(duì)K562細(xì)胞增殖抑制作用（±s）

注：與HDE 0mL/L比較，*P＜0.05，**P＜0.01

HDE/（mL/L）0 1.6 3.2 6.4 12.8 25.6 n/孔444444吸光度0.94±0.05 0.90±0.06 0.88±0.07 0.75±0.06* 0.62±0.05** 0.35±0.04*

圖1 不同濃度HDE作用對(duì)K562細(xì)胞跨膜電位的影響

3 討 論

研究表明，各種死亡信號(hào)誘導(dǎo)線粒體膜通透性改變孔（PTP）開放，引起線粒體跨膜電位下降，使膜通透性增高，導(dǎo)致促凋亡物質(zhì)釋放，繼而激活Caspase一系列酶，最終引起細(xì)胞凋亡[4]。線粒體內(nèi)膜跨膜電位（△Ψm）是反映線粒體內(nèi)膜通透性的最佳指標(biāo)之一。它發(fā)生在細(xì)胞核凋亡特征（染色質(zhì)濃縮、DNA斷裂）出現(xiàn)之前，如果線粒體跨膜電位崩潰，那么細(xì)胞凋亡將不可逆轉(zhuǎn)。當(dāng)PTP開放時(shí)，＜1.5KD的分子通過，導(dǎo)致內(nèi)膜兩側(cè)離子梯度消失，△Ψm崩潰，呼吸鏈與氧化磷酸化失偶聯(lián)，ATP合成停止，Ca2+外流，還原性谷胱甘肽和NAD（P）H2減少，超氧陰離子增加，凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）釋放等，最終引起細(xì)胞凋亡或死亡[5]。研究證實(shí)細(xì)胞凋亡的早期階段，在細(xì)胞核病理改變出現(xiàn)前，ΔΨm已經(jīng)下降，提示ΔΨm下降為凋亡的早期階段[6]。JC-1在正常細(xì)胞線粒體膜電位較高時(shí)，能聚集在線粒體的基質(zhì)中，形成聚合物，在激光共聚焦顯微鏡下可見桔黃色熒光；在凋亡早期細(xì)胞中因線粒體膜電位下降，JC-1不能聚集在線粒體的基質(zhì)中,以單體在胞漿內(nèi)積聚，在激光共聚焦顯微鏡下可見綠色熒光。

圖2 不同濃度HDE處理K562細(xì)胞48h后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果（A：1.6mL/L、B：3.2mL/L、C：6.4mL/L、D：12.8mL/L、E：25.6mL/L）

圖3 HDE處理K562細(xì)胞后Survivin和Bcl-2mRNA表達(dá)

Bcl-2家族蛋白可以調(diào)節(jié)PTP通道的開放及其細(xì)胞色素C、AIF的釋放，還可以改變線粒體外膜的通透性。癌基因產(chǎn)物絲-蘇氨酸激酶(c-Raf)蛋白與位于線粒體外膜的Bcl-2蛋白及構(gòu)成PTP通道的核心電壓依賴性陰離子孔道（VDAC）結(jié)合形成復(fù)合體，抑制VDAC誘導(dǎo)的線粒體膜去極化，干預(yù)功能性PTP通道的形成，阻斷細(xì)胞色素 C自線粒體釋放，抑制細(xì)胞凋亡[7]，而位于線粒體外膜的促凋亡因子Bax的轉(zhuǎn)位，可導(dǎo)致△Ψm降低，細(xì)胞色素 C釋放入胞質(zhì)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。因此影響B(tài)cl-2家族（特別是Bcl-2、Bax）表達(dá)的因素，均能引起細(xì)胞的凋亡或死亡。

本研究結(jié)果顯示，HDE能抑制K562白血病細(xì)胞惡性克隆增殖，HDE處理24h后就能引起K562細(xì)胞線粒體跨膜電位的下降，48h后線粒體跨膜電位下降最明顯，其后下降無明顯變化。低濃度HDE培養(yǎng)3周后能明顯抑制Survivin、Bcl-2抗凋亡基因表達(dá)，故推測(cè)HDE能抑制白血病細(xì)胞增殖，其機(jī)制可能使線粒體跨膜電位下降，導(dǎo)致通透性增加，促凋亡蛋白被釋放到細(xì)胞質(zhì)中，這些促凋亡蛋白或激活caspase、或獨(dú)立地破壞核內(nèi)染色質(zhì),從而引起細(xì)胞凋亡。

［1］Zhong LM，Zhou HX，Liu D.Recent development of studies on clinical application and phamacological functions of old?enlandia difusa wild［J］.Inf Tradit Chin Med（中醫(yī)藥信息），2001，l8（4）：14.

［2］黃景玉，王祥麒，高萍.白花蛇舌草針聯(lián)合化療治療急性非淋巴細(xì)胞白血病臨床觀察［J］.河南中醫(yī)藥學(xué)刊，2001，16（4）：38.

［3］Jiangsu New Medical College.Herbal macro-dictionary（中藥大辭典）［M］.Shanghai：Shanghai People Publishing Company，1997：754.

［4］蔡循，陳國(guó)強(qiáng)，陳竺，等.線粒體跨膜電位與細(xì)胞凋亡［J］.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2001，28（1）：3.

［5］Fall CP，Bennett JP.Visualization of cyclosporin A and Ca2+ sensitive cyclical mitochondrial depolarizations in cell culture［J］.Biochim Biophy Acta，1999，1410（1）:77.

［6］Zamzami N，Marchetti P，Castedo M，etal.Reduction in mitochondrial potential constitutes an early irreversible step of programmed lymphocyte death in vivo［J］.J Exp Med，1995， 181（5）:1661.

［7］Le Mellay V，Troppman J，Benz R，et al.Negative regulation of mitochondrial VDAC channels by C-Raf kinase［J］.BMC Cell Biol，2002，3（1）:14.

Hedyotis Herb Extracts Inhibited the Proliferation of Human Leukemia Cell Line K562 in vitro

CHEN Xiaofan. Hangzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine, Hangzhou(310006)，China

Objective:To determine the effect of hedyotis herb extracts(HDE)on the proliferation of human leukemia cell line K562 in vitro.Methods:Human leukemia cell line K562 was used and was treated by varied concentrations of HDE(1.6,3.2,6.4,12.8,25.6ml/L).Variation of mitochondrial transmembrane potential was measured be?fore and after treatment.Survivin and Bcl-2 in K562 cells were detected before and after treatment of 3.2ml/L HDE for 3 weeks.Results:HDE at the dose of 6.4m l/L inhibited the proliferation of K562 cells and the effect was enhanced as the dose increased.HDE decreased mitochondrial transmembrane potential in K562 cells and the decrease was negatively related to the concentration of HDE.The expression of survivin and Bcl-2 on K562 cells before the treatment of 3.2m l/L HDE was 2.7 and 1.6 times higher than those after treatment.Conclusion: HDE can inhibit the proliferation of K562 cells by decreasing mitochondrial transmembrane potential and sup?pressing anti-apoptosis genes.

hedyotis herb extracts K562 cells transmembrane potential apoptosis genes

2012-08-31