余澤兵 舒亦斌 雷慧慧 浙江省龍游縣人民醫(yī)院腫瘤外科 龍游 324400

胃腺癌組織Naked1和MMP-9表達(dá)及其相關(guān)性研究

余澤兵 舒亦斌 雷慧慧 浙江省龍游縣人民醫(yī)院腫瘤外科 龍游 324400

目的：觀察胃腺癌組織Naked1和MMP-9蛋白表達(dá)特征，探討兩者的關(guān)系及臨床價(jià)值。方法：選擇97例胃腺癌術(shù)后留取的蠟塊作為胃癌組，選擇62例正常胃黏膜組織作為正常對照組，應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測兩組中Naked1和MMP-9蛋白表達(dá)，觀察Naked1和MMP-9表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性。結(jié)果：胃癌組Naked1蛋白表達(dá)陽性率明顯低于正常對照組（P＜0.01），MMP-9蛋白表達(dá)陽性率明顯高于正常對照組（P＜0.01）。胃癌組Naked1和MMP-9蛋白表達(dá)與腫瘤的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度、Ki67表達(dá)密切相關(guān)（P＜0.05或P＜0.01）；Naked1和MMP-9表達(dá)具有負(fù)相關(guān)性（P＜0.05），生存分析顯示Naked1低表達(dá)、MMP-9高表達(dá)患者預(yù)后差。結(jié)論：胃腺癌組織Naked1和MMP-9呈異常表達(dá)，兩者對病變的進(jìn)展具有重要作用，術(shù)后檢測Naked1和MMP-9表達(dá)可能對判斷預(yù)后有一定價(jià)值。

胃腺癌 Naked1 MMP-9 免疫組化

胃腺癌臨床常見，侵襲和轉(zhuǎn)移是其重要的生物學(xué)行為，其發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多基因、多階段的演進(jìn)過程，其基因和蛋白的變化與患者的預(yù)后密切相關(guān)。Naked1是Wnt信號通路的重要抑制物，近來研究顯示Naked1低表達(dá)與腫瘤的生物學(xué)行為密切相關(guān)，并對病變進(jìn)展有促進(jìn)作用[1]?；|(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）是細(xì)胞外基質(zhì)降解蛋白的經(jīng)典成員，其高表達(dá)可以促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測胃腺癌組織Naked1和MMP-9表達(dá)，探討其關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材 料 收集我院2005年1月—2007年11月胃腺癌手術(shù)后的蠟塊組織作為觀察組，納入均符合WHO中關(guān)于胃腺癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)經(jīng)兩位病理主治醫(yī)師再次確診。排除術(shù)前放、化療的患者，排除臨床隨訪資料不完整患者。本組共97例，其中男50例，女47例，年齡39～76歲，平均55.8歲；PTNM分期：I期3例，II期45例，III期40例，IV期9例。同時(shí)選取距腫物邊緣超過5cm的切緣正常胃黏膜組織62例作為對照組，其中男32例，女30例，年齡37～76歲，平均55.1歲。兩組一般臨床特征比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 Naked1、MMP-9和ki67蛋白檢測 實(shí)驗(yàn)用兔抗人多克隆Naked1、MMP-9和ki67蛋白濃縮液均購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司，正式實(shí)驗(yàn)前均進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，選擇最佳稀釋比例。Naked1、MMP-9和ki67的表達(dá)應(yīng)用免疫組化SP法進(jìn)行檢測，操作均由同一位主管病理技師完成，同時(shí)嚴(yán)格按照說明書操作，做好免疫組化質(zhì)量控制。

1.3 免疫組化結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) Naked1、MMP-9和ki67蛋白的結(jié)果判斷均經(jīng)兩位病理主治醫(yī)師判讀。陽性染色部位均定位于細(xì)胞質(zhì)中，以棕黃色的顆粒樣著色為陽性細(xì)胞，選擇8個(gè)高倍視野（×400），以陽性細(xì)胞占全部計(jì)數(shù)細(xì)胞的百分率表示，取平均值。以平均每個(gè)高倍視野計(jì)數(shù)的呈陽性反應(yīng)的細(xì)胞數(shù)≥25%為陽性，無明顯陽性反應(yīng)或陽性反應(yīng)細(xì)胞數(shù)＜25%為陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)應(yīng)用SAS 6.12統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，應(yīng)用卡方檢驗(yàn)、相關(guān)分析及生存分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃腺癌及正常胃黏膜組織中Naked1和MMP-9表達(dá) 胃腺癌組織Naked1表達(dá)陽性率明顯低于正常胃黏膜組織（P＜0.01），MMP-9表達(dá)陽性率明顯高于正常胃黏膜組織（P＜0.01），見表1。

表1 胃腺癌及正常胃黏膜組織Naked1和MMP-9表達(dá)比較 例（%）

2.2 胃腺癌組織Naked1和MMP-9表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 胃腺癌組織Naked1和MMP-9表達(dá)與腫瘤的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度和Ki67表達(dá)密切相關(guān)（P＜0.05或P＜0.01），見表2。

表2 胃腺癌組織Naked1和MMP-9表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 例（%）

2.3 胃腺癌組織Naked1和MMP-9表達(dá)的相關(guān)性

經(jīng)線性相關(guān)分析顯示，胃腺癌組織Naked1和MMP-9表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.49，P＝0.0210）。

2.4 胃腺癌組織Naked1和MMP-9表達(dá)與患者生存率的關(guān)系 本組患者術(shù)后均經(jīng)正規(guī)系統(tǒng)的治療，20例患者接受TCF方案化療；33例患者應(yīng)用FEP方案進(jìn)行化療；44例患者應(yīng)用FOLFOX方案進(jìn)行化療，治療時(shí)間2～4個(gè)周期。本組患者隨訪時(shí)間為8～60個(gè)月，平均30.2個(gè)月。經(jīng)生存分析顯示，胃腺癌組織Naked1和MMP-9表達(dá)與生存時(shí)間相關(guān)（χ2=9.76，P= 0.0239），即Naked1低表達(dá)、MMP-9高表達(dá)的患者預(yù)后差，見圖1～2。

3 討論

胃腺癌機(jī)制及生物學(xué)行為復(fù)雜，其發(fā)生發(fā)展過程中基因和蛋白均明顯改變。Naked1蛋白目前已被證實(shí)為經(jīng)典的Wnt信號通路的抑制物[2]，在許多正常組織內(nèi)均明顯表達(dá)，還可能具有調(diào)節(jié)黏附蛋白的作用[3-4]。Naked1蛋白表達(dá)下降，會失去對Wnt信號通路活性的抑制，可能對細(xì)胞外基質(zhì)有一定調(diào)節(jié)作用[5]。MMPs是一組結(jié)構(gòu)上具有很大同源性，并能有效降解細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白質(zhì)，因?yàn)榻Y(jié)構(gòu)中含有金屬離子（主要是鋅和鈣）而得名[6]。MMP-9是基質(zhì)金屬蛋白酶家族的重要成員，其發(fā)揮作用時(shí)能夠在細(xì)胞的表面對MMP-2等MMPs家族的成員進(jìn)行有效活化，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤離開原發(fā)部位發(fā)生轉(zhuǎn)移[7]。也有研究顯示MMP-9可以誘導(dǎo)腫瘤的間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生多種酶，該酶激活后被腫瘤細(xì)胞攝取到細(xì)胞膜表面，起到降解細(xì)胞外基質(zhì)的作用[8-9]。

圖1 Naked1蛋白表達(dá)與胃腺癌預(yù)后的關(guān)系

圖2 MMP-9蛋白表達(dá)與胃腺癌預(yù)后的關(guān)系

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，胃腺癌組織Naked1和MMP-9異常表達(dá)，提示兩者表達(dá)失調(diào)對腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展有重要作用。胃腺癌組織Naked1和MMP-9表達(dá)均與腫瘤的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度和Ki67表達(dá)密切相關(guān)，提示兩種蛋白參與了胃腺癌的進(jìn)展，即兩者參與了腫瘤的脈管播散和增殖過程。相關(guān)分析顯示，Naked1和MMP-9的表達(dá)具有協(xié)同負(fù)向作用，即兩者可能具有互相調(diào)節(jié)的通路作用。Naked1可能通過MMP-9對細(xì)胞外基質(zhì)的降解調(diào)節(jié)腫瘤的進(jìn)展。Naked1異常表達(dá)使Wnt/β-catenin通路發(fā)生障礙，引起胞漿內(nèi)未被磷酸化降解的β-catenin進(jìn)入核內(nèi)[10]，進(jìn)而調(diào)節(jié)MMP-9的改變，促進(jìn)腫瘤出現(xiàn)侵襲和轉(zhuǎn)移。生存分析顯示，Naked1低表達(dá)、MMP-9高表達(dá)患者生存時(shí)間短，提示聯(lián)合檢測二種蛋白對預(yù)后判斷可能有重要價(jià)值，由于臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度和Ki67也是和腫瘤預(yù)后相關(guān)的重要因素，因此說明Naked1和MMP-9可以作為胃腺癌預(yù)后的判斷指標(biāo)。Naked1可能是機(jī)體腫瘤進(jìn)展的多元性信號，對腫瘤發(fā)生時(shí)轉(zhuǎn)錄水平、黏附作用和細(xì)胞外基質(zhì)的調(diào)節(jié)均有效果，但是具體機(jī)制尚有待更多實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

總之，胃腺癌組織Naked1和MMP-9蛋白異常表達(dá)，二者可能具有協(xié)同作用，共同促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展，術(shù)后聯(lián)合檢測Naked1和MMP-9的表達(dá)對判斷胃腺癌的預(yù)后有一定價(jià)值。

［1］Schneider I，Schneider PN，Derry SW，et al.Zebrafish Nkd1 promotes Dvl degradation and is required for left-right pat?terning［J］.Dev Biol，2010，348（1）:22-33.

［2］Hu T，Krezel AM，Li C，et al.Structural studies of human Na?ked2:a biologically active intrinsically unstructured protein［J］.Biochem Biophys Res Commun，2006，350（4）:911-912.

［3］趙月，孫波，張盛，等.非小細(xì)胞肺癌中Naked1的表達(dá)及意義［J］.臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2012，28（3）:257-259.

［4］Van Raay TJ，Coffey RJ，Solnica-Krezel L.Zebrafish Naked1 and Naked2 antagonize both canonical and non-canonical Wnt signaling［J］.Dev Biol，2007，309（2）:151-168.

［5］Van Raay TJ，F(xiàn)ortino NJ，Miller BW，et al.Naked1 antagonizes Wnt signaling by preventing nuclear accumulation of β-catenin［J］.PLoS One，2011，6（4）:e18650.

［6］劉愛東，王玥，龐久玲，等.基質(zhì)金屬蛋白酶7和轉(zhuǎn)化生長因子β1在病理性瘢痕中的表達(dá)：與正常瘢痕及正常皮膚組織比較［J］.中國組織工程研究，2012，16（7）:1165-1168.

［7］劉愛東，龐久玲，劉士生.胃癌中基質(zhì)金屬蛋白酶-9和CD105表達(dá)關(guān)系的研究［J］.中國老年學(xué)雜志，2009，29（7）:886-887.

［8］劉士生，李巍，劉愛東，等.基質(zhì)金屬蛋白酶-9和上皮型黏附素在胃癌中的表達(dá)［J］.北京醫(yī)學(xué)，2008，30（9）:554-557.

［9］劉愛東，龐久玲，郭紅輝.基質(zhì)金屬蛋白酶-9在胃癌中的表達(dá)及意義［J］.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2011，20（18）: 2226-2227.

［10］Zhang S，Wang Y，Dai SD，et al.Down-regulation of NKD1 increases the invasive potential of non-small-cell lung cancer and correlates with a poor prognosis［J］.BMC Cancer，2011，20（11）:186.

修回日期：2012-07-30

Correlation between Naked1 and Matrix Metalloproteinase 9 in Gastric Adenocarcinoma

YU Zebing，SHU Yibin，LEI Huihui.The People's Hospital of Longyou County，Longyou(324400)，China

Objective:To explore the relationship between Naked1 and matrix metalloproteinase 9(MMP-9)in gastric adenocarcinoma and its potential role in prognosis.Methods:Specimens from gastric adenocarcinoma tissue (n=97)and normal gastric tissue(n=62)were harvested.Expression of Naked1 and MMP-9 was determined by using immunohistochemistry.Results:Compared with the normal gastric tissue,Naked1 expression was lower but MMP-9 was higher in the gastric adenocarcinoma tissue.Naked1 and MMP-9 expression was closely related to clinical stage of carcinoma,metastasis,infiltration,and Ki67(P＜0.05 or P＜0.01).Naked1 was negatively related to MMP-9(P＜0.05).Survival analysis showed that lower expression of Naked1 and higher expression of MMP-9 was associated with poor prognosis.Conclusion:Naked1 is negatively correlated with MMP-9 in gastric adenocarcinoma and they may play a potential role in determining prognosis of gastric adenocarcinoma patients.

gastric adenocarcinoma Naked1 MMP-9 immunohistochemistry

2012-07-02