商思霞　尹琳琳　孫惠強等

[摘要] 目的 探討對體外培養(yǎng)的成骨細胞增殖活性促進作用最佳的17-β雌二醇的濃度及作用時間、流體剪切力（FSS）的力值及作用時間，以及此雙因素共同作用對成骨細胞增殖活性的影響。方法 成骨細胞系MC3T3-E1細胞

傳代培養(yǎng)后，分別對其施加不同濃度的17-β雌二醇和不同力值的FSS，采用MTT法檢測細胞的增殖情況，并檢測ALP活性，篩選出最佳的濃度及力值；再將二者共同作用于MC3T3-E1細胞，檢測其增殖情況和ALP活性。結(jié)果 濃度為10-8 mol·L-1的17-β雌二醇作用5 d時，MC3T3-E1細胞的增殖及ALP活性優(yōu)于其他17-β雌二醇處理組；FSS力值為12×10-5 N作用60 min時細胞的增殖及ALP活性大于其他FSS處理組。當二者同時作用于MC3T3-E1細胞時，細胞的增殖活性大于任一單因素處理組。結(jié)論 17-β雌二醇和FSS對成骨細胞活性的促進作用皆有一個適宜的閾值；二者具有協(xié)同作用，對成骨細胞分化及增殖功能的影響優(yōu)于單一因素作用。

[關(guān)鍵詞] 17-β雌二醇； 流體剪切力； 協(xié)同作用； 成骨細胞

[中圖分類號] Q 25 [文獻標志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.01.016 正常狀態(tài)下骨形成與骨吸收處于一種平衡狀態(tài)，該平衡是由成骨細胞介導的新骨形成和破骨細胞介導的骨吸收作用來實現(xiàn)的。MC3T3-E1細胞株是成骨分化研究中的經(jīng)典細胞株，很多學者將其用于骨形成機制的研究[1]。影響成骨及破骨細胞增殖及活性的因素有很多，雌激素和應(yīng)力是影響成骨細胞活性及增殖的重要因素[2]。

研究[3-4]表明：雌激素對成骨細胞的功能有促進作用。還有學者[5]發(fā)現(xiàn)：流體剪切力（fluid shear stress，F(xiàn)SS）能夠活化成骨細胞的跨膜受體，促進成骨細胞增

殖。Yeh等[6]通過研究證實：雌激素可以通過雌激素受體增加成骨細胞對FSS的敏感性。本實驗采用MC3T3-E1成骨細胞系，對其施加不同濃度的17-β雌二醇及不同力值的FSS，探討17-β雌二醇、FSS以及二者共同作用對成骨細胞增殖活性的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

MC3T3-E1第3代細胞株（ADCC公司，美國）。17-β雌二醇、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、MTT（Sigma公司，美國），胰蛋白酶（Gibco公司，美國），含105 U·L-1青霉素及100 mg·L-1鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清（Gibco公司，美國），堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）試劑盒（南京建成生物有限公司），Triton X-100（Fluka公司北京原生生物

技術(shù)有限公司分裝）。Multiskan MK3酶聯(lián)免疫檢測儀（Thermo公司，美國），平行板流室加力裝置（四川大學華西口腔醫(yī)學院FSS課題組提供）。

1.2 細胞培養(yǎng)及傳代

將第3代MC3T3-E1細胞系用α-MEM培養(yǎng)基（含體積分數(shù)為10%胎牛血清、105 U·L-1青霉素及100 mg·L-1鏈霉素）在37 ℃、5%CO2潮濕環(huán)境下培養(yǎng)，2～3 d換

液1次，待細胞均勻一層鋪滿培養(yǎng)瓶底部時，用0.25%胰蛋白酶消化獲得細胞，用于后續(xù)實驗。

1.3 實驗方法

1.3.1 17-β雌二醇處理分組 將用于17-β雌二醇處理的細胞等分為A、B、C、D、E共5組，每組再分為4個小組，分別標記為A1、A2、A3、A4、B1、B2、B3、B4……以此類推。在A、B、C、D組的培養(yǎng)基中分別添加濃度為10-10、10-9、10-8、10-7 mol·L-1的17-β雌二醇，每一大組的4個小組分別培養(yǎng)1、3、5、7 d。E組為對照組，不加17-β雌二醇，其余處理同實驗組。設(shè)置30個重復樣本。

1.3.2 FSS處理分組 將用于FSS處理的細胞等分為a、b、c、d、e、f共6組，每組再分為3個小組，分別標記為a1、a2、a3、b1、b2、b3……以此類推。將各組細胞接種于放置在六孔板中的蓋玻片上，移入細胞培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)至細胞完全貼壁。采用平行板流室加力裝置分批次對a、b、c、d、e組細胞分別施加每平方厘米力值為2×10-5、6×10-5、12×10-5、20×10-5、25×10-5 N的力，每組中3個小組的作用時間分別為15、60、120 min。f組為對照組，不施加FSS，其余處理同實驗組。設(shè)置30個重復樣本。

1.3.3 FSS+17-β雌二醇雙因素處理分組 經(jīng)上述實驗篩選出17-β雌二醇的最佳濃度和最佳培養(yǎng)天數(shù)后，設(shè)置雙因素作用組Ⅰ、FSS組Ⅱ、17-β雌二醇組Ⅲ、對照組Ⅳ。各組細胞的接種方法同1.3.2，其中Ⅰ、Ⅲ組添加最佳濃度的17-β雌二醇進行培養(yǎng)，Ⅱ、Ⅳ組添加等量DMSO培養(yǎng)，常規(guī)培養(yǎng)經(jīng)1.3.1步驟篩選出的最佳天數(shù)后，Ⅰ、Ⅱ組施加經(jīng)1.3.2步驟篩選出的最佳力值及時間。設(shè)置30個重復樣本。

1.3.4 MTT檢測 在規(guī)定時間內(nèi)，將實驗樣本用0.25%胰蛋白酶消化獲取懸浮細胞，將細胞分別置于EP管離心5 min，接種于96孔板中，添加適量培養(yǎng)基，靜置培養(yǎng)6 h至細胞完全貼壁后，每孔加入5 g·L-1的MTT溶液20 μL，37 ℃繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入150 μL DMSO，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，然后置于酶聯(lián)免疫檢測儀上檢測，波長為490 nm，記錄光密度A值。空白對照組做相同處理。

1.3.5 ALP活性檢測 獲取細胞及接種方法同上，根據(jù)ALP試劑盒的說明，分別加入試劑1、2液50 μL離心5 min后加入試劑3液50 μL，置于酶聯(lián)免疫檢測儀上檢測，選擇520 nm波長，記錄吸光度A值?？瞻讓φ战M做相同處理。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學分析，同一時間組內(nèi)比較采用單因素方差分析，不同時間組間兩兩比較使用秩和檢驗，檢驗水準為雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 17-β雌二醇處理組

不同濃度17-β雌二醇作用不同時間后，經(jīng)MTT檢測得到的A值見表1。從表1可見：同一處理時間，C組（10-8 mol·L-1組）多優(yōu)于其他實驗組，實驗組多優(yōu)于E組（對照組）；各處理時間組的表現(xiàn)趨勢相同，均隨著17-β雌二醇濃度的增高，成骨細胞活性增強，達到高峰后逐漸回落。各時間組的增長百分比結(jié)果見圖1，可見各時間段的曲線趨勢大致相同，隨著17-β雌二醇濃度的升高，曲線升高，達到峰值后開始回落，其中5、7 d組中D組（10-7 mol·L-1組）呈現(xiàn)明顯負增長，5 d組中C組（10-8 mol·L-1組）明顯高于其他各組。

ALP結(jié)果的分析趨勢與MTT相同，表現(xiàn)為C3組成骨細胞分化活性最佳。

2.2 FSS處理組

2.2.1 細胞形態(tài)觀察 倒置相差顯微鏡下觀察可見：FSS作用前細胞呈多角形、梭形，排列無序（圖2左）；

FSS作用后細胞呈長梭形，細胞長軸沿力的方向排列（圖2右）。

2.2.2 MTT檢測結(jié)果 不同力值的FSS作用不同時間后，MTT檢測結(jié)果見表2：每個作用時間組內(nèi)，隨著力值增大，A值呈上升趨勢，到達高峰后，隨著力值繼續(xù)增大，A值則呈下降趨勢；在3組數(shù)據(jù)中，作用60 min組明顯高于其他組。經(jīng)統(tǒng)計學檢驗，1組（作用15 min組）內(nèi)各實驗組與對照組的差異無統(tǒng)計學意

義（P>0.05）；2組（作用60 min組）內(nèi)，c2組（12×10-5 N）優(yōu)于其他各組，e2組（25×10-5 N）低于對照組（P<0.05）；3組（作用120 min組）的趨勢與2組相同。

2.2.3 ALP檢測結(jié)果 ALP檢測結(jié)果見表3。經(jīng)統(tǒng)計學分析，ALP的變化趨勢與MTT結(jié)果基本相同，c2組（12×10-5 N作用60 min）成骨細胞的增殖活性最佳。

2.3 FSS+17-β雌二醇雙因素處理組

將篩選出的最佳濃度（10-8 mol·L-1）17-β雌二醇和最佳FSS力值（12×10-5 N）用作雙因素處理，不同處理組的MTT和ALP檢測結(jié)果見表4。MTT數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示：Ⅰ組大于其他3組（P<0.05），Ⅱ、Ⅲ組之間無明顯差異（P>0.05），但均大于對照組（P<0.05）。ALP數(shù)據(jù)分析結(jié)果與MTT的變化趨勢基本相同，Ⅰ組的ALP活性最強，且優(yōu)于Ⅱ、Ⅲ組。

3 討論

隨著我國國民結(jié)構(gòu)的老齡化，骨質(zhì)疏松患病率的增高、骨折危險性的增加及牙齒缺失后牙槽骨的吸收都成為現(xiàn)代醫(yī)學亟需解決的問題。如何維持骨改建的平衡，促進骨的生長和重建，抑制或減緩骨吸收成為近年研究的熱點。影響骨改建的因素很多，

雌激素和FSS刺激是其中2個重要的因素[2]，目前關(guān)

于這2種因素影響骨改建的研究也是一大熱點。

雌激素是由卵巢分泌的一種性激素，能夠維持機體的生理功能，可用來治療由于雌激素缺乏所導致的各種疾病。這種替代療法已得到普遍應(yīng)用。雌二醇可以通過雌激素受體抑制成骨細胞凋亡，促進成骨細胞增殖，提高ALP活性，促使骨基質(zhì)礦化。有研究[7]發(fā)現(xiàn)：成骨細胞是雌二醇的直接靶器官。本實驗結(jié)果顯示：成骨細胞的活性并不始終與17-β雌二醇的濃度呈正相關(guān)關(guān)系，在17-β雌二醇濃度為10-8 mol·L-1作用5 d時，細胞的增殖活性最佳，而隨著濃度的繼續(xù)升高，增殖活性開始降低。

機械應(yīng)力是影響骨改建的另一個重要因素，適當?shù)臋C械應(yīng)力刺激能夠促進骨組織的生長。在骨改建過程中，成骨細胞的增殖和分化有重要的作用。吳丹等[8]研究證實：FSS作用于成骨細胞后，其增殖能力提高，細胞活性增強。本研究結(jié)果表明：對體外培養(yǎng)的MC3T3-E1細胞施加FSS，力值為12×10-5 N作用60 min時，其促增殖效果最明顯；加力后可見細胞長軸沿力的方向排列。FSS施加力值和時間長短不同，成骨細胞的反應(yīng)也不同。隨著力加載時間的延長，成骨細胞對應(yīng)力的敏感性減弱，這可能與其逐步適應(yīng)了應(yīng)力刺激有關(guān)。當力值較大時，細胞活性反而降低，提示過大的應(yīng)力非但不能促進成骨細胞的增殖反而會抑制其生長活性。在有關(guān)成骨細胞的體外研究中，應(yīng)注意FSS強度的取值范圍。

Genetos等[9]研究證實：骨小管內(nèi)液體的流動對

成骨細胞的作用主要由剪應(yīng)力介導。FSS加載裝置有很多種，平行板流室加載系統(tǒng)有其獨特的優(yōu)勢，在平行板流動小室里，能夠達到層流和二維流動，通過調(diào)節(jié)蠕動泵來提供穩(wěn)定有效的FSS，而且設(shè)備輕便，培養(yǎng)基更換方便，易于培養(yǎng)，易于鏡下觀察，加力所需培養(yǎng)基的量也較少。本實驗所采用的四川大學獲取專利的FSS加載裝置能夠精確地控制力值的大小[10]，較好地模擬了體內(nèi)骨組織的成骨細胞受到的應(yīng)力狀態(tài)，其施加的FSS大小均一，并且可以調(diào)節(jié)到很小的范圍，得到的實驗結(jié)果具有代表性。

成骨細胞受到10-8 mol·L-1的17-β雌二醇和12×10-5 N的力影響時，細胞增殖活性明顯高于單純施加10-8 mol·L-1的17-β雌二醇和單純施加12×10-5 N的加力組，提示17-β雌二醇和FSS對成骨細胞具有協(xié)同作用。這可能與二者提高了成骨細胞對彼此的敏感性有關(guān)，亦有可能與二者共同促進某一離子通道的開放或者激活某一信號通路有關(guān)。

綜上所述，由本實驗可以得出以下結(jié)論：濃度為10-8 mol·L-1的17-β雌二醇作用5 d時，成骨細胞的增殖活性優(yōu)于其他17-β雌二醇處理組；FSS力值為12×10-5 N作用60 min時，成骨細胞的增殖活性大于其他FSS處理組；當二者同時作用于成骨細胞時，其增殖活性大于任一單因素處理組，此雙因素具有協(xié)同作用。本實驗為探討體外培養(yǎng)成骨細胞的骨代謝相關(guān)信號傳導通路提供了一定的參考。

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（本文編輯 吳愛華）