付 莉，宋建新，岳喜慶

（1.遼寧醫(yī)學(xué)院食品學(xué)院，遼寧錦州121001；2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧沈陽110161）

母乳是適合嬰兒生長發(fā)育的最完美的食物。但是，有的母親因?yàn)閭€人、文化、社會經(jīng)濟(jì)和健康等原因選擇人工哺乳。當(dāng)母乳缺乏時，牛乳因其來源廣泛、與母乳成分較為接近而常被用來作為母乳的替代品。而牛乳與人乳蛋白質(zhì)含量與成分的差異是牛乳不適癥產(chǎn)生的主要原因。經(jīng)研究表明，引起嬰兒過敏的蛋白質(zhì)主要為αs-酪蛋白、α-乳白蛋白及β-乳球蛋白。目前，牛乳蛋白質(zhì)致敏性降低的方法主要有超濾、物理處理、生物轉(zhuǎn)化、酶水解，而由于酶水解后苦味較低，省時，經(jīng)濟(jì)，有功能新肽的產(chǎn)生而被廣泛研究[1-2]。利用酶法降低牛乳蛋白致敏性，酶的類型，酶的水解條件對產(chǎn)物的分子量、抗原性、苦味程度都有很大的影響，Ena J M等[3]研究表明，肽分子量低于3400u就不會引起過敏反應(yīng)，Beresteijn等[4]研究表明，肽分子量在3000～5000u可誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。大量研究顯示，降低牛乳蛋白質(zhì)致敏性的研究多集中于單一的酪蛋白或乳清蛋白，因此本研究嘗試以牛乳為研究對象，基于降低牛乳蛋白抗原性獲得低苦味程度的牛乳蛋白水解物為目的，利用單酶或混合酶處理牛乳，為低致敏性嬰兒配方乳的研制打下前期基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

新鮮牛乳 錦州市售（主要成分蛋白質(zhì)3.2%、脂肪3.6%、乳糖4.5%、水分88%、灰分0.70%）；胰蛋白酶（18380.23U/g）、風(fēng)味蛋白酶（15285.71U/g）、胃蛋白酶（6230U/g）、堿性蛋白酶（18761.90U/g）、中性蛋白酶（13847.19U/g）、木瓜蛋白酶（15285.71U/g） 購于天津諾奧科技酶制劑公司；低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白（97400～14400u） 購于上海生物化學(xué)研究所；茚三酮、果糖、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、氯化鉀、濃硫酸、碳酸鈉、鄰苯二胺二鹽酸、鄰苯二胺、明膠、吐溫、無水乙醇、30%H2O2均為分析純；乙睛、三氟乙酸 為色譜純；αs-酪蛋白、β-乳球蛋白、羊抗兔IgG-HRP、α-乳白蛋白、牛血清白蛋白（66ku）、胰蛋白酶抑制劑（31ku）、溶菌酶（14.4ku）、抑肽酶（6.5ku）、胰島素b（3.5ku）、人血管緊張肽II（1040u）購于Sigma公司。

SHA-B型恒溫水浴振蕩器 江蘇金壇市宏華儀器廠；SP-752型紫外可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；DYY-6C型電泳儀、DYCZ-24B型電泳槽 北京六一儀器廠；9018型96孔酶標(biāo)板 Corning Costar公司；Thermo Multiskan MK3酶標(biāo)儀 Thermo Electron公司；快速蛋白質(zhì)色譜儀 Pharmacia公司，色譜柱為Superdex-75 HR 10/30柱；FD-1B-80型真空冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 牛乳蛋白水解工藝 將新鮮牛乳，預(yù)熱10min，分別加入0.4%風(fēng)味蛋白酶反應(yīng)60min，0.8%胰蛋白酶反應(yīng)60min，先加入0.8%胰蛋白酶40min、再加入0.4%風(fēng)味蛋白酶20min，通過不斷加入0.5%的氫氧化鈉維持體系pH8.0，55℃振蕩60min，反應(yīng)過程中每隔10min取水解液并放入90℃水浴滅酶10min，冷卻，取原乳和水解液稀釋，利用茚三酮比色法測定牛乳蛋白的水解度。90℃水浴滅酶10min滅酶后的水解液，5000r/min離心10min，取上清，凍干，-20℃保存，用于液相色譜分析。

式中，DH：水解度（%）；h：水解后每克蛋白被裂解的肽鍵毫摩爾數(shù)（mmol）；htot：每克原料蛋白質(zhì)的肽鍵毫摩爾數(shù)（mmol）；N×F：全脂乳蛋白質(zhì)含量（g/L）；[-NH2]水解液：水解液的-NH2的含量（mmol/L）；[-NH2]原料：原料乳的-NH2的含量（mmol/L）；8.3：mmol/g。

1.2.2 水解液的SDS-PAGE分析 用5%濃縮膠和15%分離膠，樣品于濃縮膠中在80V電壓下運(yùn)行1h，于分離膠中在120V電壓下運(yùn)行3h。用0.05%（W/V）（醋酸∶醇∶水=1∶5∶5）考馬斯亮藍(lán)R250染色45min，然后放入脫色液（醋酸∶甲醇∶水=3∶2∶40）中脫色，以低分子量Marker標(biāo)準(zhǔn)為參比，得到所需蛋白條帶分子。上樣量均為15μL。

1.2.3 水解液的快速蛋白質(zhì)液相色譜分析 水解液凍干粉（1mg/mL）溶解在含有0.15mol/L氯化鈉，0.05mol/L磷酸鹽pH7.0緩沖液中，樣品經(jīng)0.22μm膜過濾，上樣量為100μL，洗脫速度為0.25mL/min，檢測器波長為280nm。柱子先用以下各標(biāo)準(zhǔn)品平衡，牛血清白蛋白（66ku）、胰蛋白酶抑制劑（31ku）、溶菌酶（14.4ku）、抑肽酶（6.5ku）、胰島素b（3.5ku）、人血管緊張肽II（1040u）。

1.2.4 多克隆抗體的制備及樣品抗原性測定[5]

1.2.4.1 克隆抗體的制備 選取8周齡健康日本大白兔6只，分三組，喂養(yǎng)不含乳蛋白的飼料。每組分別皮下多點(diǎn)注射αs-酪蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和等體積混合的弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑，每只兔子免疫劑量為2mg/mL，每隔兩周免疫1次，免疫4次。每次免疫前，耳緣靜脈取血后，采用雙向免疫擴(kuò)散法測定抗血清的效價。效價合格后，動脈取血，37℃放置1h凝血后，4℃冰箱放置過夜，4000r/min離心3min分離血清，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4.2 抗原測定 間接競爭Elisa法[6]。

1.2.4.3 抗原包被 用包被液將α-乳白蛋白稀釋為2.5μg/mL，β-乳球蛋白稀釋為1.0μg/mL，αs-酪蛋白稀釋為1.0μg/mL，分別取100μL加入96孔酶標(biāo)板中，4℃過夜。

1.2.4.4 抗原與抗體預(yù)混 反應(yīng)管中加入稀釋后待測樣品和等體積稀釋后的抗血清。同時一個反應(yīng)管中只放抗血清不加樣品為無競爭管。4℃冰箱放置過夜。

1.2.4.5 洗滌 次日恢復(fù)至室溫，傾去孔內(nèi)液體，每孔加入300μL PBST洗滌4次，每次3min，于干凈吸水紙上拍干。

1.2.4.6 封閉 每孔加入100μL 1.5%明膠，37℃保溫1h，恢復(fù)至室溫，傾去封閉液，PBST洗滌4次，每次3min，于干凈吸水紙上拍干。

1.2.4.7 抗原抗體反應(yīng) 將抗原抗體預(yù)混液100μL加入酶標(biāo)板中，置于濕盒中，37℃培養(yǎng)1h。反應(yīng)結(jié)束后，傾去孔內(nèi)液體，PBST洗滌4次，每次3min，于干凈吸水紙上拍干。

1.2.4.8 加酶標(biāo)抗抗體 每孔加入100μL 1∶5000稀釋后的HRP-羊抗兔IgG，置于濕盒中，37℃培養(yǎng)1h，反應(yīng)結(jié)束后，傾去孔內(nèi)液體，PBST洗滌4次，每次3min，于干凈吸水紙上拍干。

1.2.4.9 顯色 每孔加入100μL HRP底物溶液，置于濕盒中，37℃培養(yǎng)20min，顯示黃色。

1.2.4.10 終止反應(yīng) 每孔加入50μL 2mol/L H2SO4，終止反應(yīng)。

1.2.4.11 比色 用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm測定每孔液體吸光值。

1.2.4.12 抗原降低率計算 抗原降低率（%）=（A樣品-A原乳/A無競爭-A原乳）×100

2 結(jié)果與討論

2.1 水解用酶的篩選

牛乳中分別加入0.1%的胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶，分別于37、55、55、50、50、37℃水解60min，綜合水解度、苦味程度、色澤、狀態(tài)，篩選出水解效果較好的蛋白酶。

表1顯示綜合水解度、苦味程度、色澤、狀態(tài)變化考慮，同等條件下采用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶水解牛乳蛋白效果較好。胰蛋白酶是內(nèi)切蛋白酶，可特異性水解連接賴氨酸和精氨酸羧基的肽鍵。因此產(chǎn)生的疏水肽較少，使苦味降低[7]。風(fēng)味蛋白酶含有外切和內(nèi)切蛋白酶活性，通過內(nèi)切蛋白酶切斷多肽內(nèi)部的肽鍵，形成短鏈肽，其中一些含有疏水氨基酸而呈苦味肽，使用外切酶從苦味肽末端切斷釋放氨基酸，從而把苦味肽徹底降解為氨基酸，可有效降低水解度產(chǎn)物的苦味，增進(jìn)和改善水解液的風(fēng)味。但是牛乳經(jīng)木瓜蛋白酶水解后分層嚴(yán)重且苦味較重，不適合后期配制嬰兒配方乳，而牛乳經(jīng)胰蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶水解后，水解度最高，且苦味較小，因此本實(shí)驗(yàn)選定胰蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶為水解用酶進(jìn)行后續(xù)研究。

表1 不同蛋白酶對牛乳蛋白水解度的影響Table 1 Effect of different proteases on milk protein hydrolysis degree

2.2 反應(yīng)時間與水解度之間關(guān)系

圖1 各種酶水解度與時間關(guān)系圖Fig.1 The relationship between DH and time

圖1顯示了牛乳在不同酶水解條件下水解度隨時間的變化情況，胰蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶及兩種酶分階段水解的前40min，水解度增長速度較快，而40min后水解度增長較緩慢。其中胰蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶分階段水解效果好于兩種酶單獨(dú)水解。風(fēng)味蛋白酶屬于內(nèi)外切混合酶，胰蛋白酶屬于內(nèi)切酶，先加入胰蛋白酶使蛋白質(zhì)產(chǎn)生大量短肽，然后再加風(fēng)味蛋白酶水解短肽，這種水解方式的效果更好，所以導(dǎo)致兩種酶分階段水解效果較好[8]。水解60min后，胰蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、胰蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶分段水解后水解度分別達(dá)到24.6%、20%、26%。Svenning指出蛋白質(zhì)水解程度不應(yīng)該過大，否則會使終產(chǎn)品太苦而口感不好，且產(chǎn)生大量自由氨基酸不如小肽更容易被人體吸收[9]，因此，這樣的水解效果對產(chǎn)品而言是可以接受的。

2.3 不同反應(yīng)時間內(nèi)αs-酪蛋白抗原性的變化

圖2顯示了隨著水解時間的增加，風(fēng)味蛋白酶水解液中αs-酪蛋白抗原性降低率逐漸增加，胰蛋白酶水解液中αs-酪蛋白的抗原降低率先增加后減少而后又增加。胰蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶分步水解液的αs-酪蛋白抗原降低率也是先增加后減少而后又增加。主要原因是αs-酪蛋白有過敏表位，隨著胰蛋白酶水解的進(jìn)行，有的過敏表位被水解掉，但同時又有些隱藏在內(nèi)部的過敏表位又暴露出來，反而增強(qiáng)了其抗原性。水解前40min各組蛋白酶水解液αs-酪蛋白抗原降低較快，40min后αs-酪蛋白抗原降低較慢。水解60min后，胰蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和胰蛋白酶分步水解液的抗原降低率分別達(dá)到83%、93%、96%。

圖2 酶水解時間與酪蛋白抗原降低率關(guān)系圖Fig.2 The relationship between time and antigen lower rate

2.4 不同反應(yīng)時間內(nèi)α-乳白蛋白抗原性的變化

圖3 酶水解時間與α-乳白蛋白抗原降低率關(guān)系圖Fig.3 The relationship between time and antigen lower rate of α-lactalbumin

圖3顯示了隨著水解時間的增加，三組蛋白酶水解液的α-乳白蛋白抗原降低率均逐漸增加，水解前40min抗原降低較快，而40min后抗原降低率趨于平緩。水解60min后，胰蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、胰蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶水解產(chǎn)物中α-乳白蛋白抗原性降低率分別達(dá)到91%、93%、96%。α-乳白蛋白的抗原性較β-乳球蛋白易于去除，Ena研究結(jié)果一致[10]。

2.5 不同反應(yīng)時間內(nèi)β-乳球蛋白抗原性的變化

圖4顯示了隨著水解時間的增加，胰蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶水解液β-乳球蛋白的抗原降低率逐漸減少，水解前40min抗原降低較快，而40min后抗原降低趨于平緩。而胰蛋白酶水解40min后加入風(fēng)味蛋白酶，β-乳球蛋白的抗原降低率升高較快。水解60min后，三組蛋白酶水解也中β-乳球蛋白抗原性降低率分別達(dá)到13%、55%、71%。胰蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、胰蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶水解液蛋白抗原降低率相比，β-乳球蛋白對蛋白酶的抵抗能力較強(qiáng)，抗原性下降相對較低。

圖4 酶水解時間與β-乳球蛋白抗原降低率關(guān)系圖Fig.4 The relationship between time and antigen lower rate of β-lactoglobulin

2.6 水解液的SDS-PAGE分析

水解60min后，三組蛋白酶水解液及原乳的SDSPAGE圖如圖5所示，胰蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶分步水解液中αs-酪蛋白幾乎完全被水解掉，而風(fēng)味蛋白酶和胰蛋白酶水解液中有少量αs-酪蛋白殘余，三組蛋白酶水解液中β-乳球蛋白含量均有下降，但仍有一定量殘存。三組蛋白酶水解液中α-乳白蛋白含量下降較明顯，殘留量均較少。經(jīng)胰蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶分步水解后，產(chǎn)生大量分子量小于14.4ku的肽類，胰蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶水解液中也有一定量低分子量的肽產(chǎn)生。

圖5 牛乳與牛乳水解液的SDS-PAGE圖Fig.5 SDS-PAGE of full fat milk and its hydrolyzate

2.7 水解液的快速蛋白質(zhì)液相色譜分析

圖6 分子量分布測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 Standard curve of molecular weight distribution

圖6顯示了利用快速蛋白質(zhì)液相色譜檢測出標(biāo)準(zhǔn)蛋白的分子量與洗脫體積的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖7 胰蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶分步水解液的分子量分布圖Fig.7 Molecular weight distribution of trypsin and flavourzyme hydrolysis by step

圖7為反應(yīng)60min后胰蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶分步水解液的分離曲線，水解液被分離出7個組分，分別標(biāo)識為a、b、c、d、e、f、g，這幾個組分的分子量分別為145900、6735、4944、3630、2664、1676、1230u，經(jīng)過胰蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶分步水解后分子量主要集中在5000u以下，只有少量分子量集中在1ku以上，充分說明，αs-酪蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白大量被水解后轉(zhuǎn)變?yōu)樾》肿恿康碾念悺?/p>

3 結(jié)論

通過研究發(fā)現(xiàn)，胰蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶單獨(dú)水解及胰蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶分步水解牛乳，均可使α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、αs-酪蛋白的抗原性降低，且胰蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶分步水解使各蛋白質(zhì)的抗原降低率更為明顯，尤其對于β-乳球蛋白的抗原降低率更大，水解產(chǎn)物苦味更低。雙酶分步水解后有大量的分子量低于5000u的肽產(chǎn)生，雖然多數(shù)構(gòu)象抗原表位被水解掉，仍然有線性表位存在，仍然有過敏性，還需繼續(xù)研究。

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