吳占敖，范利娟，許華君，端禮榮

(1.解放軍第359 醫(yī)院口腔科，江蘇 鎮(zhèn)江212001;2.解放軍第359 醫(yī)院呼吸內(nèi)科，江蘇 鎮(zhèn)江212001;3.中國鹽業(yè)總公司鎮(zhèn)江鹽化公司，江蘇 鎮(zhèn)江212001;4.江蘇大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江212013)

氣溶膠鹽療法是最近幾年從俄羅斯引進的一種控微氣候物理治療方法，其特點是利用干燥NaCl微粒氣霧在仿鹽礦氣候的環(huán)境內(nèi)造成最佳的溫濕度條件，通過患者吸入而發(fā)揮其治療作用。目前，該法已作為一種治療哮喘、支氣管炎癥等呼吸道疾病的新型非藥物方法應(yīng)用于臨床。其中發(fā)揮治療作用的是5 ～8 μm 大小的干燥氯化鈉氣霧顆粒［1]。為保障人體用藥安全，需要確定超細氯化鈉粉的安全性。小鼠骨髓微核試驗是藥品注冊技術(shù)規(guī)范國際協(xié)調(diào)會(International Conference on Harmonization，ICH)推薦的檢測致突變物質(zhì)標準實驗，以小鼠骨髓嗜多染紅細胞(polychromatic erythrocyte，PCE)中的微核數(shù)目作為評價化學(xué)物質(zhì)毒性的指標，具有經(jīng)濟、快速、準確的特點［2-5]。本研究對BALB/c 小鼠連續(xù)予不同濃度的超細氯化鈉粉(pM 2.5-10)灌胃后，觀察小鼠骨髓細胞的毒性反應(yīng)，并通過計算骨髓細胞的微核率，對超細氯化鈉粉進行安全毒理學(xué)評價。

1 材料與方法

1.1 材料

超細氯化鈉粉(pM2.5-10)為白色顆粒，溶于水，由江蘇省金壇鹽礦提供。環(huán)磷酰胺(CP)由上海華聯(lián)制藥有限公司生產(chǎn);姬姆薩染液為上海江萊生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 動物

6 ～8 周齡BALB/c 小鼠，雌性，清潔級，體質(zhì)量18 ～20 g，由揚州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供。自由攝水，室溫(24 ±2)℃，濕度45% ～65%，適應(yīng)性喂養(yǎng)3d 后進行試驗。

1.3 小鼠急性毒性試驗

小鼠50 只，在預(yù)試驗基礎(chǔ)上，隨機分為3 個劑量組，超細氯化鈉粉劑量范圍為高、中、低(5.0、2.5、1.25 mg/kg)，另設(shè)正常對照組、陽性對照組，共5 組，每組10 只，試驗前禁食6 h，其中3 個劑量組經(jīng)口灌服不同濃度的超細氯化鈉粉溶液，連續(xù)觀察14d，陽性對照組給予腹腔注射環(huán)磷酰胺(CP)40 mg/kg，正常對照組采用腹腔注射生理鹽水。記錄小鼠中毒表現(xiàn)及死亡情況。

1.4 小鼠骨髓細胞微核試驗

選用體質(zhì)量18 ～20 g 雌性小鼠50 只，隨機分為5 組，每組10 只，超細氯化鈉粉劑量組(試驗組)經(jīng)口灌服，給藥量分別為5.0、2.5、1.25 mg/kg，陽性對照組環(huán)磷酰胺的給藥量為40 mg/kg，采用腹腔注射，正常對照組采用腹腔注射生理鹽水。多次染毒，每天染毒1 次，連續(xù)5d，末次染毒后6 h 后用頸椎脫臼法處死小鼠，取股骨或取胸骨，擦凈血污，剔去肌肉，剪去每節(jié)骨骺，用小型彎止血鉗取骨髓涂片，固定，Giemsa 染色。在低倍顯微鏡下選擇細胞完整、分散均勻、著色適當?shù)膮^(qū)域，用油鏡觀察，每張涂片計數(shù)約1000 個胞質(zhì)清晰完整的嗜多染紅細胞(PCE)的微核率，結(jié)果以千分率(‰)表示。

1.5 統(tǒng)計處理

應(yīng)用SPSS 16.0 統(tǒng)計軟件進行分析，微核率均以ˉ±s表示，采用單因素方差分析及χ2檢驗進行統(tǒng)計學(xué)處理，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠急性毒性及一般觀察試驗

由表1 可知，小鼠經(jīng)口灌服不同劑量的超細氯化鈉粉后，5.0 mg/kg 組小鼠活動稍減弱，部分小鼠出現(xiàn)食欲稍減低，體質(zhì)量在第2 天開始下降，但初始體質(zhì)量(g)與5 天體質(zhì)量(g)比較無明顯變化。2.5 mg/kg 組和1.25 mg/kg 組的體質(zhì)量均無變化，與對照組比較，各超細氯化鈉粉處理組體質(zhì)量均無明顯差異(P＞0.05)。各組均無小鼠死亡，小鼠生長良好。陽性對照組(CP)體質(zhì)量減輕明顯(P＜0.05)。

表1 各組小鼠體質(zhì)量的變化Tab 1 Changes of body weight in every group

2.2 小鼠骨髓細胞微核率的變化

陽性對照組(CP)微核細胞率為(111.6 ±25.5)‰，超細氯化鈉粉5.0 mg/kg 組微核細胞率為(13.7 ±2.89)‰，2.5 mg/kg 組為(9.1 ±2.99)‰，1.25 mg/kg 組為(8.2 ±3.05)‰，而正常對照組微核細胞率為(5.9 ±1.66)‰。與正常對照組比較，環(huán)磷酰胺組微核率明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=25.6，P＜0.001)。超細氯化鈉粉各劑量組間微核細胞數(shù)比較，差異無明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。超細氯化鈉粉各組與正常對照組比較，差異無明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，說明超細氯化鈉粉對小鼠骨髓PCE 無致突變作用。見圖1。

圖1 各組小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核數(shù)(油鏡×400)Fig 1 Numbers of bone marrow micronucleus of mice

3 討論

無著絲粒的染色體片段或因紡錘體受損而丟失的整個染色體，在細胞分裂后期仍留在子細胞的胞質(zhì)內(nèi)成為微核。這種情況的出現(xiàn)往往是受到染色體斷裂劑作用的結(jié)果［7]。微核試驗是檢測染色體或有絲分裂器損傷的一種遺傳毒性試驗方法。微核試驗作為檢測染色體損傷最常用而有效的細胞遺傳學(xué)檢測方法之一，已被當今多國和國際組織列為誘變試驗的常規(guī)方法，并將其規(guī)定為新藥、食品添加劑、農(nóng)藥、化妝品等毒理學(xué)安全性評價的必做試驗［8]。近年來，鹽療的應(yīng)用領(lǐng)域不斷拓展，一些知名的研究機構(gòu)已加入到鹽療技術(shù)的開發(fā)過程中。本課題組前期實驗結(jié)果已顯示，天然礦鹽粉吸入療法能改善哮喘小鼠肺部炎癥［9]，本試驗進一步觀察超細NaCl 對小鼠的遺傳毒性，通過小鼠急性毒性、一般觀察試驗及微核試驗，未顯示超細氯化鈉粉對小鼠具有明顯毒性，特別是骨髓嗜多染紅細胞微核率未見明顯增加，表明在試驗劑量范圍內(nèi)，超細氯化鈉粉無致突變性。本次實驗結(jié)果為將鹽粉應(yīng)用于呼吸道疾病的治療提供了實驗依據(jù)。

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