張效偉

ZH ANG Xiao－wei

（青島理工大學(xué)理學(xué)院，山東 青島 266033）

（School of Science，Qingdao Technological University，Qingdao，Shandong 266033，China）

隨著微機(jī)電系統(tǒng)和微制造技術(shù)的迅速發(fā)展，科學(xué)儀器的小型化、集成化、自動化已成為一個重要研究方向［1，2］。二維分離是近年發(fā)展起來的一種新型復(fù)合分離技術(shù)，與一維分離模式相比，二維分離可以極大地提高分辨率和峰容量，便捷地調(diào)整分離選擇性，待測組分在不同的分離模式下進(jìn)行分離，各組分間的分離效率不受后續(xù)分離的影響［3］，因此二維分離已成為近期重要研究熱點(diǎn)。迄今為止，二維色譜的研究已比較成熟，然而二維毛細(xì)管電泳的研究還處于初始階段，主要原因是二維毛細(xì)管間的切換接口難于制作，目前的微加工技術(shù)難以達(dá)到毛細(xì)管柱對柱外死體積的要求，已報道的二維毛細(xì)管接口有微透析接口［4］、多孔蝕刻接口［5］、十字交叉型接口［6，7］、微進(jìn)樣器接口［8］和切向開孔接口［9］等。上述報道的二維毛細(xì)管電泳存在柱間死體積大、柱外效應(yīng)高、柱效損失大等缺陷，嚴(yán)重?fù)p失整個分離系統(tǒng)的分離效率和分辨率；且在二維切換接口處區(qū)帶擴(kuò)散嚴(yán)重、或損失部分待測物，影響檢測靈敏度。

在前期研究［10］中，本課題組制作了微孔接口用于二維毛細(xì)管電泳分離，分離效率高，無樣品損失，但接口制作較困難，且采用手動切換二維過程，重現(xiàn)性較低。為克服柱間接口制作的難題，又嘗試了在一根毛細(xì)管中進(jìn)行中心切割二維毛細(xì)管電泳分離在柱電化學(xué)檢測，裝置簡單，靈敏度高，但在二維切換過程中采用流體壓力驅(qū)送，樣品區(qū)帶擴(kuò)散嚴(yán)重，自動化程度低［11，12］。

為克服上述問題，本試驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了基于電磁閥切換和電動驅(qū)動的二維分離系統(tǒng)，采用電泳和電滲等電動驅(qū)動二維分離全過程，無脈動、無區(qū)帶擴(kuò)散、重現(xiàn)性好；用電磁閥代替手動切換二維過程，自動化程度高，易于微型化和自動化。電滲泵運(yùn)行和電磁閥工作狀態(tài)以及二維分離的工作參數(shù)通過控制接口卡由計(jì)算機(jī)控制，填寫控制軟件的各分析步驟參數(shù)，二維分離系統(tǒng)可按輸入?yún)?shù)自動運(yùn)行。利用最終搭建的全二維分離檢測系統(tǒng)對8種食品添加劑進(jìn)行分析，驗(yàn)證系統(tǒng)的各項(xiàng)性能。

1 電磁閥切換電動驅(qū)動二維分離原理

基于電磁閥切換電動驅(qū)動的二維毛細(xì)管電泳分離原理（圖1）：首先將電磁閥置于①位，在第一維、第二維毛細(xì)管中充滿第一維分離緩沖液，接通第一維分離高壓，樣品溶液在電泳和電滲流的作用下進(jìn)入毛細(xì)管，向檢測端遷移的同時進(jìn)行第一維分離（圖1（a））；一旦檢測器D1檢測到樣品區(qū)帶B的信號，斷開高壓電源，將電磁閥置于②位，開啟電滲泵，將第二維毛細(xì)管充滿第二維分離緩沖液（圖1（b））；將電磁閥置于①位，樣品區(qū)帶A、B在電滲泵的驅(qū)動下進(jìn)入第二維毛細(xì)管中（圖1（c））；當(dāng)?shù)谝痪S分離的樣品區(qū)帶都進(jìn)入第二維毛細(xì)管后，停止電滲泵，電磁閥置于②位，接通第二維分離高壓，第一維分離的樣品區(qū)帶在第二維緩沖液中進(jìn)一步進(jìn)行第二維分離（圖1（d））。

2 系統(tǒng)設(shè)計(jì)

2.1 系統(tǒng)總體結(jié)構(gòu)

圖1 電磁閥切換電動驅(qū)動二維分離原理圖Figure 1 Principle of two－dimensional separation with solenoid valve switch and electrokinetic drive

基于電磁閥切換和電動驅(qū)動的全二維分離系統(tǒng)由可控高壓電源模塊、電滲驅(qū)動電磁閥切換模塊、二維分離檢測模塊、控制和數(shù)據(jù)采集模塊組成。系統(tǒng)的整體結(jié)構(gòu)見圖2，采取分步研究－集成調(diào)控－分析應(yīng)用的步驟，首先分別研究系統(tǒng)的各功能模塊；然后研究電磁閥切換和電滲泵接口卡以及VC語言程序，將各功能模塊通過計(jì)算機(jī)控制實(shí)現(xiàn)自動化操作，并設(shè)計(jì)USB數(shù)據(jù)采集電路，實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)的采集、存儲和圖譜的繪制；最后將基于電磁閥切換和電動驅(qū)動的全二維分離系統(tǒng)集成為自動化程度高的智能分析，并應(yīng)用到復(fù)雜樣品的在線分離分析。

圖2 系統(tǒng)總體結(jié)構(gòu)圖Figure 2 Schematic diagram of the whole system

2.2 電磁閥切換電動驅(qū)動模塊

電磁閥切換電動驅(qū)動模塊由一個電磁閥和1臺電滲泵組成，連接裝置結(jié)構(gòu)示意圖見圖3，其功能包括流路切換、輸運(yùn)樣品溶液至下級分離單元以及驅(qū)動溶液向檢測端流動。電磁閥有4個流路通道，用于不同流路的切換注入。在本體系中，流路④始終關(guān)閉，流路③始終接通，當(dāng)電磁閥置于①位時，流路①③接通；當(dāng)電磁閥置于②位時，流路①關(guān)閉、②③接通。電滲泵用于驅(qū)動溶液流動，泵芯為硼玻璃燒結(jié)柱，泵芯外殼為玻璃管，管兩端與泵電極腔通過管套螺紋密封相連。電滲區(qū)為固定于玻璃管內(nèi)的多孔玻璃芯柱，泵流量和流向通過改變泵電壓和極性控制。電磁切換閥引線插頭、電滲泵引線插頭和電泳電極池的電極引線插頭連接至系統(tǒng)基座的相應(yīng)插座上，插座的引線通過插接件與控制接口單元相連。同流體壓力驅(qū)動相比，采用電滲泵驅(qū)動流量穩(wěn)定無脈動、容易控制電壓的高低和極性變換，并且結(jié)構(gòu)簡單、操作方便。

圖3 電磁閥切換電動驅(qū)動模塊示意圖Figure 3 Schematic diagram of solenoid valve switch and electrokinetic drive module

2.3 可控高壓電源模塊

可控高壓電源模塊結(jié)構(gòu)見圖4。將高壓電源整流濾波后的直流電壓變換成高頻脈沖電壓，經(jīng)開關(guān)變壓器升壓，二次整流濾波后成直流高壓，經(jīng)取樣電路、A／D轉(zhuǎn)換和比較電路，其誤差信號經(jīng)D／A轉(zhuǎn)換由控制電路進(jìn)行電壓調(diào)整，得到直流穩(wěn)壓電源。圖5為高壓電源模塊工作原理圖，根據(jù)電磁閥切換和電動驅(qū)動的全二維分離系統(tǒng)的要求，高壓電源模塊提供穩(wěn)定可控的高壓電源，陽極高壓輸出在0～30 k V范圍內(nèi)可通過計(jì)算機(jī)控制連續(xù)調(diào)節(jié)，輸出電壓的波動范圍小于0.5%，波紋系數(shù)小于2%。采用絕緣性、密閉性和防潮性較好的高壓輸出電纜和較好的高壓屏蔽保護(hù)?？煽刂绷鞲邏悍€(wěn)壓電源輸出的工作電壓經(jīng)控制接口提供給電磁閥、電滲泵和二維電泳分離單元電極池的電極，控制接口單元也向電滲泵提供極性變換的工作電壓并為電磁切換閥提供通斷的工作電壓，控制接口單元再連接至微電腦單元輸入接口。

圖4 可控高壓電源模塊結(jié)構(gòu)示意圖Figure 4 Schematic diagram of the controllable high voltage module

圖5 高壓電源模塊工作原理圖Figure 5 Principle of high voltage module

2.4 系統(tǒng)軟件設(shè)計(jì)

系統(tǒng)軟件設(shè)計(jì)提供儀器整體系統(tǒng)的協(xié)調(diào)控制和硬件系統(tǒng)運(yùn)行參數(shù)的設(shè)置，實(shí)現(xiàn)下述功能：高壓系統(tǒng)的調(diào)整及顯示控制、電動進(jìn)樣控制、第一維分離控制、電磁閥切換控制、電滲泵電壓和極性控制、第二維分離控制、數(shù)據(jù)采集和軟件濾波。系統(tǒng)的軟件采用VC語言編程，采用多線程技術(shù)，在工作線程中進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，并實(shí)時顯示，使系統(tǒng)控制與數(shù)據(jù)采集協(xié)調(diào)執(zhí)行，為操作者提供方便的可視工作界面，實(shí)現(xiàn)包括進(jìn)樣、溶液驅(qū)送、分離、檢測等功能?？刂撇糠至鞒虉D見圖6，通過設(shè)定其參數(shù)，讓硬件分析模塊返回相應(yīng)的分析數(shù)據(jù)，以便軟件系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)的譜圖成像，配合其他軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的二次處理和譜圖還原。

圖6 系統(tǒng)軟件控制部分函數(shù)流程圖Figure 6 Function flow chart of the software for control section

3 試驗(yàn)部分

3.1 試劑

山梨酸、苯甲酸、脫氫乙酸鈉、丙酸鈉、對羥基苯甲酸丙酯、沒食子酸丙酯、丁基羥基茴香醚、糖精、β－環(huán)糊精（β－CD）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、醋酸（HAc）、無水醋酸鈉（Na Ac）、四硼酸鈉（Na2B4O7）、硼酸：分析純，上?；瘜W(xué)試劑公司。

3.2 試驗(yàn)方法

基于電磁閥切換電動驅(qū)動的二維毛細(xì)管電泳分離操作步驟（表1）：首先將電磁閥置于①位，在第一維、第二維毛細(xì)管中充滿第一維分離緩沖液（20 mmol／L Na Ac／HAc），K1接通，樣品溶液在10 k V下電動進(jìn)樣10 s；然后將樣品池?fù)Q成第一維分離緩沖液，分析物在10 k V下進(jìn)行第一維分離，一旦檢測器D1檢測到食品添加劑的信號，立即停止第一維分離電壓；將電磁閥置于②位，開啟電滲泵，第二維分離緩沖液（50 mmol／L Na2B4O7＋30 mmol／L SDS＋10 mmol／L β－CD）進(jìn)入第二維毛細(xì)管中，電滲泵的流量為3.0 m L／min，此時毛細(xì)管中的溶液以0.76 cm／s的速度流動，53 s即可將第二維毛細(xì)管充滿第二維分離緩沖液；將電磁閥置于①位，第一維分離的樣品區(qū)帶在電滲泵的驅(qū)動下進(jìn)入第二維毛細(xì)管中，12 s后，所有的樣品區(qū)帶都進(jìn)入第二維毛細(xì)管，停止電滲泵；電磁閥置于②位，K2接通，樣品區(qū)帶在第二維緩沖液中進(jìn)一步進(jìn)行第二維分離。

表1 電磁閥切換電動驅(qū)動二維毛細(xì)管電泳分離8種食品添加劑Table 1 Separation of 8 food additives with 2D CE separation based on solenoid valve switch and electrokinetic drive

4 結(jié)果與討論

為考察基于電磁閥切換電動驅(qū)動的二維毛細(xì)管電泳分離檢測系統(tǒng)的性能，試驗(yàn)以8種食品添加劑為檢測物質(zhì)，分別對進(jìn)樣、第一維分離、第二維分離、二維切換等條件進(jìn)行了優(yōu)化，選擇進(jìn)樣和分離電壓10 k V，進(jìn)樣時間10 s；第一維分離緩沖液為20 mmol／L NaAc／HAc，p H 3.0；第二維分離緩沖液為50 mmol／L Na2B4O7＋30 mmol／L SDS＋10 mmol／L β－CD，p H 9.0；電滲泵流量為3.0 m L／min。整個二維分離過程的電泳譜圖見圖7。由圖7可知，經(jīng)過第一維分離，8種食品添加劑分成了3個區(qū)帶，進(jìn)一步經(jīng)第二維分離后，8種食品添加劑完全達(dá)到基線分離，說明二維分離體系的峰容量、分辨率和分離度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于一維分離。

研究了8種食品添加劑的工作曲線、線性范圍、回歸方程和檢出限，由表2可知，檢出限為0.05～0.2μg／m L。樣品連續(xù)測定8次，分別計(jì)算8個峰的峰高和遷移時間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，其值分別為2.2%～3.8%和1.3%～2.7%，結(jié)果表明系統(tǒng)重復(fù)性好。為驗(yàn)證系統(tǒng)的可靠性，對2種飲料和2種餅干中的8種食品添加劑進(jìn)行了回收率試驗(yàn)，回收率在95.2%～103.1%，表明系統(tǒng)準(zhǔn)確可靠，可用于實(shí)際樣品的測定。

圖7 電磁閥切換電動驅(qū)動二維毛細(xì)管電泳分離檢測8種食品添加劑Figure 7 Separation and detection of 8 food additives with 2D CE separation based on solenoid valve switch and electrokinetic drive

表2 系統(tǒng)的分析性能參數(shù)Table 2 Performance parameters of the system

5 結(jié)論

本試驗(yàn)研究了基于電磁閥切換和電動驅(qū)動的二維毛細(xì)管電泳分離系統(tǒng)。采用電泳和電滲等電動作用驅(qū)動二維分離全過程，將電磁選擇閥用于二維分離過程的切換，無樣品區(qū)帶擴(kuò)散、分離效率高、自動化程度高、重現(xiàn)性好。利用該系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了食品中8種添加劑的高分辨率、高靈敏度分離檢測，證明系統(tǒng)準(zhǔn)確可靠，可用于實(shí)際樣品的測定。

1 崔波，程云輝，鐘秋平.毛細(xì)管電泳在多肽分離和檢測中的應(yīng)用［J］.食品與機(jī)械，2004，20（3）：45～47.

2 宋宏新，劉立新，柏紅梅，等.牛乳中蛋白質(zhì)的電泳分析技術(shù)研究［J］.食品與機(jī)械，2010，26（6）：51～53.

3 Rutan S C，Davis J M，Carr P W.Fractional coverage metrics based on ecological home range for calculation of the effective peak capacity in comprehensive two－dimensional separations［J］.Journal of Chromatography A，2012，1 255（17）：267～276.

4 Yang C，Liu H，Yang Q，et al.On－line hyphenation of capillary isoelectric focusing and capillary gel electrophoresis by a dialysis interface［J］.Analytical Chemistry，2003，75（2）：215～218.

5 Liu H，Zhang L，Zhu G，et al.An etched porous interface for on－line capillary electrophoresis－based two－dimensional separation system［J］.Analytical Chemistry，2004，76（21）：6 506～6 512.

6 Zhu C，He X，Kraly J M，et al.Instrumentation for mediumthroughput two－dimensional capillary electrophoresis with laserinduced fluorescence detection［J］.Analytical Chemistry，2007，79（2）：765～768.

7 Li Y，Wojcik R，Dovichi N J.A replaceable microreactor for online protein digestion in a two－dimensional capillary electrophoresis system with tandem mass spectrometry detection［J］.Journal of Chromatography A，2011，1 218（15）：2 007～2 011.

8 Zhang M，El Rassi Z.Two－dimensional microcolumn separation platform for proteomics consisting of on－line coupled capillary isoelectric focusing and capillary electrochromatography［J］.Journal of Proteome Research，2006，5（8）：2 001～2 008.

9 Sahlin E.Two－dimensional capillary electrophoresis using tangentially connected capillaries［J］.Journal of Chromatography A，2007，1 154（1～2）：454～459.

10 Zhang Z，Zhang X，Zhang S.Heart－cut capillary electrophoresis for drug analysis in mouse blood with electrochemical detection［J］.Analytical Biochemistry，2009，387（2）：171～177.

11 Zhang X，Zhang Z.Heart－cut two－dimensional separation method via hyphenation of micellar electrokinetic capillary chromatography and capillary zone electrophoresis using analyte focusing by micelle collapse［J］.Journal of Chromatography B，2011，879（19）：1 641～1 646.

12 Zhang Z，Du X，Li X.Sweeping with electrokinetic injection and analyte focusing by micelle collapse in two－dimensional separation via integration of micellar electrokinetic chromatography with capillary zone electrophoresis［J］.Analytical Chemistry，2011，83（4）：1 291～1 299.