章偉

摘 要：土壤硝化、反硝化是產(chǎn)生有害溫室氣體N2O主要的生物化學(xué)過(guò)程。除了原核細(xì)菌外還發(fā)現(xiàn)真核生物真菌（包括菌根真菌）也能參與土壤的硝化和反硝化過(guò)程并排放N2O?；|(zhì)誘導(dǎo)抑制呼吸法（SIR）是目前研究真菌與細(xì)菌對(duì)N2O排放通量貢獻(xiàn)的主要方法。該方法應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：（1）誘導(dǎo)劑的選擇應(yīng)該根據(jù)不同土壤的理化性質(zhì)選擇，一般選擇的誘導(dǎo)劑為葡萄糖，也有選擇蛋白胨作為誘導(dǎo)劑。（2）預(yù)實(shí)驗(yàn)確定飽和誘導(dǎo)劑的量。（3）抑制劑應(yīng)根據(jù)土壤理化性質(zhì)進(jìn)行選擇，一般選擇的抑制劑為放線菌酮和鏈霉素。（4）確定IAR，最大抑制率的時(shí)間。（5）真菌、細(xì)菌對(duì)N2O排放貢獻(xiàn)量時(shí)間段的確定。

關(guān)鍵詞：SIR；真菌；細(xì)菌；N2O；森林土壤

中圖分類號(hào) S15 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2013）05-19-02

空氣中N2O氣體的增加會(huì)導(dǎo)致全球變暖[1]，此外N2O也直接或間接破壞平流層中的臭氧[2]。有研究表明，來(lái)自土壤硝化和反硝化產(chǎn)生的N2O占全球大氣N2O的90%。森林土壤又是N2O的重要排放源[3-4]，因此對(duì)森林土壤N2O排放機(jī)理的研究對(duì)估計(jì)和控制全球N2O的排放通量尤為重要。

土壤中硝化-反硝化作用是產(chǎn)生N2O的主要過(guò)程[6-7]。從目前認(rèn)識(shí)的土壤N2O排放機(jī)理看，原核生物細(xì)菌一直被認(rèn)為是土壤N2O產(chǎn)生的主要參與者[5-6]。但最近的研究表明，實(shí)際過(guò)程遠(yuǎn)比想像中的復(fù)雜，除了原核細(xì)菌外，還發(fā)現(xiàn)真核生物真菌（包括菌根真菌）也能參與土壤的硝化和反硝化過(guò)程并排放N2O[8]。細(xì)菌在完全厭氧條件下才能快速、完全地發(fā)生反硝化，相比之下真菌可以使用NO3-作為電子受體來(lái)進(jìn)行呼吸作用和反硝化作用。許多真菌由于缺乏將N2O還原為N2的還原酶而使真菌的N2O產(chǎn)生數(shù)量和效率更高。如真菌P450nor催化NO還原的速度約為300μmol/min·kg，是細(xì)菌NO還原酶的5倍[9]。許多真菌能通過(guò)共同反硝化作用產(chǎn)生N2O，即通過(guò)結(jié)合從NO2-和其它氮化合物的氮原子產(chǎn)生雜合的N2O分子，但Baggs and Philippot[10]認(rèn)為共同反硝化對(duì)土壤釋放N2O的貢獻(xiàn)即使到今天我們還有許多未知。目前這些研究主要集中在國(guó)外，國(guó)內(nèi)還未見(jiàn)報(bào)道。

真核生物的內(nèi)部代謝過(guò)程與原核生物有很大的不同，外部的影響因素（比如溫度、O2分壓、含水量、pH）也非常不同[11]。

Anderson和Domsch分別在1973、1975年利用基質(zhì)誘導(dǎo)呼吸抑制方法（SIR）測(cè)量土壤微生物真菌和細(xì)菌的生物量。Anderson和Domsch發(fā)現(xiàn)土壤在加入葡萄糖后，由于土壤微生物增殖，土壤中CO2排放量在2～8h內(nèi)可以保持一個(gè)穩(wěn)定的高排放量。新的呼吸量可以一直持續(xù)到微生物群落增長(zhǎng)的停滯階段，在此期間呼吸量可以指示土壤生物量的多少。Anderson和Domsch在1975年通過(guò)添加細(xì)菌抑制劑（鏈霉素）和真菌抑制劑（放線菌酮）來(lái)測(cè)量細(xì)菌和真菌對(duì)土壤生物量呼吸的相對(duì)貢獻(xiàn)量。

1 計(jì)算方法及數(shù)據(jù)處理

細(xì)菌與真菌生物量比例計(jì)算方法：

細(xì)菌生物量比例：（A-B）/（A-D）；

真菌生物量比例：（A-C）/（A-D）；

真菌細(xì)菌比率（FBR）：（A-C）/（A-B）；

抑制劑添加比率（IAR）：[（A-B）+（A-C）]/（A-D）。

其中，A為僅加入葡萄糖土壤的CO2呼吸量，B為加入葡萄糖和鏈霉素土壤的CO2呼吸量，C為加入葡萄糖和放線菌酮土壤的CO2呼吸量，D為加入葡萄糖鏈霉素及放線菌酮土壤的CO2呼吸量。IAR值接近于1說(shuō)明基質(zhì)誘導(dǎo)呼吸抑制法效果達(dá)到最佳。

2 討論

添加誘導(dǎo)劑的量應(yīng)使加入的量在1～10h時(shí)間段內(nèi)土壤CO2呼吸量保持一個(gè)穩(wěn)定排放量。抑制劑的量的確定方法應(yīng)考慮以下2個(gè)方面：（1）單獨(dú)加抑制劑使得土壤呼吸量達(dá)到最小；（2）同時(shí)加抑制劑使抑制劑添加比率IAR接近1。培養(yǎng)時(shí)間段至關(guān)重要，因?yàn)榧词棺罴训囊种菩Ч?，長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)可能導(dǎo)致CO2排放量的浮動(dòng)，因?yàn)榛畹奈⑸锟赡芾盟赖奈⑸锟扇芙馕镔|(zhì)作為能量或者營(yíng)養(yǎng)源。FBR值的大小確定真菌、細(xì)菌2種菌體哪種是土壤的主要活性物質(zhì)。Imberger和Velvi分別利用抑制劑方法測(cè)得FBR值在1.05～2.28。然而有的實(shí)驗(yàn)測(cè)定FBR變動(dòng)很大，甚至出現(xiàn)負(fù)值，可能有以下幾個(gè)原因：（1）一些抑制劑可能吸附了土壤成分，改變了抑制劑原有作用，造成抑制劑在培養(yǎng)階段沒(méi)有充分發(fā)揮作用。（2）一些抑制劑可能作為其他微生物能源物質(zhì)被利用。（3）抑制劑抑制了某一微生物的生長(zhǎng)，同時(shí)刺激另一微生物的生長(zhǎng)。

放線菌酮呈中性，較少吸附于土壤顆粒，而鏈霉素呈堿性，可以強(qiáng)烈地吸附在土壤顆粒上，由于不同的土壤吸附能力不一樣，所以在實(shí)際操作中必須預(yù)先確定每一種土壤的抗生素最合適的用量。由于抗生素可以吸附于土壤顆粒而失效，同時(shí)又可作為微生物的C源，所以在最合適用量范圍內(nèi)，盡可能加大用量，同時(shí)縮短培養(yǎng)時(shí)間。

土壤中真菌在微生物生物量占主要地位，真菌群落受到環(huán)境因素的影響（比如溫度、O2分壓、含水量、pH）很大[12]。因此，細(xì)菌與真菌的比值在不同土壤中變化很大。土壤反硝化是對(duì)土壤N2O排放貢獻(xiàn)影響最大的過(guò)程之一，這個(gè)過(guò)程主要受到真菌和細(xì)菌活動(dòng)的影響。在同時(shí)加入2種抑制劑土壤中也有N2O排放；可能有以下幾種原因：（1）在加抑制劑的條件下培養(yǎng)，組成酶仍然具有活性；（2）在有抑制劑條件下，雖然新的酶不能合成，但是舊的酶降解速度很慢，還沒(méi)有降解完成；（3）抑制劑可能成為非目標(biāo)微生物的基質(zhì)。

根據(jù)研究的分析結(jié)果可知，土壤中N2O主要產(chǎn)生于微生物的硝化和反硝化過(guò)程[12]，各個(gè)環(huán)節(jié)對(duì)土壤N2O排放的貢獻(xiàn)量都是不一樣的，且因土壤性質(zhì)不同，差異較大。

3 展望

由于真菌在氧限制的一定條件下可以同時(shí)進(jìn)行反硝化和氧氣呼吸，所以在有氧條件下真菌產(chǎn)生的N2O比細(xì)菌產(chǎn)生得多。真菌廣泛存在土壤和水中，所以真菌的存在對(duì)全球N2O預(yù)算起著很重要的作用。

根據(jù)研究，真菌對(duì)土壤N2O排放的影響是非常復(fù)雜的過(guò)程，目前還有許多問(wèn)題需要解決：（1）菌根真菌在反硝化過(guò)程中所起的作用是將來(lái)研究的重點(diǎn)。由于目前的研究真菌對(duì)土壤N2O的排放的貢獻(xiàn)的實(shí)驗(yàn)都是在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行的，但是在長(zhǎng)時(shí)間的變化趨勢(shì)還尚未清楚。（2）利用N15觀察氣體來(lái)源和去向，清晰地解釋氮循環(huán)。（3）可以通過(guò)C13同位素追蹤真菌碳在反硝化微生物群落的流向，進(jìn)一步確定微生物對(duì)N2O的貢獻(xiàn)量。（4）SIR方法的使用必須預(yù)先確定抑制劑的合適用量，抑制劑的用量是否與顆粒含量有關(guān)需進(jìn)一步研究。（5）SIR方法與其他方法同時(shí)應(yīng)用，以檢查結(jié)果的準(zhǔn)確性。

參考文獻(xiàn)

[1]Hansen J.Greenhouse gas growth rate[J].proc.Natl.Acad.Sci.，2004，101（46）：16 109-16 114.

[2]Dyominov and Zadorozhny. Contribution of naturl and anthropogenic factors to the long-term changes of the earths ozone layer at the end the XX century [J].Izv.Atmos.Ocean.Phys.，2005，41：43-55.

[3]Cole D W，Rapp M.Elemental cycling in forest ecosystems//Heichle D E.Dynamic properties of forest ecosystems[C].London：Cambridge University Press，1981：341-409.

[4]Butterbach-Bahl K，Rothe A，Papen H. Effect of tree distance on N2O and CH4 fluxes from soil in temperate forest ecosystems[J].Plant and Soil，2002，2 240（240）：91-103.

[5]Takaya N.and Shoun H.Nitric oxide reduction，the last.step of the fungal denitrification by Fusarium oxysporum is obligatorily mediated by cytotochrome P45nor[J].Mol.Gen.Genet.，2000，263：342-348.

[6]Johnson C.Measuring bacterial and fungal substrate-induced respiration in dry soils[J].Soil Boil.Biochem.，1996，28：427-432.

[7]Laughlin R J.Determining nitrogen-15 in ammonium by producing nitrous oxide[J].Soil Sci.Soc.Am.，1997，61：462-465.

[8]Ruzicka S，D Edgerton，M Norman，T Hill.The utility of ergosterol as a bioindicator of fungi in temperate soils[J].Soil Boil .Biochem，2000，32：989-1 005.

[9]Merrick M J ， Edwards R A.Nitrogen control in bacteria [J].Microbial，Rev.，1995，59：604-622.

[10]Marzluf Ga.Genetic regulation of nitrogen metabolism in the fungi[J].Microbiol Mol Boil Rev，1997，61：17-32.

[11]路福平.微生物學(xué)[M].北京： 中國(guó)輕工業(yè)出版社，2005： 116-175.

[12]續(xù)勇波，蔡祖聰.亞熱帶土壤氮素反硝化過(guò)程中N2O的排放和還原[J]. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2008，28（4）：731-737. （責(zé)編：徐世紅）