日孜旺古麗·蘇皮　王麗麗　李克梅　阿不都克尤木　李超

摘 要：為了確定石榴冠癭病的病原菌，對(duì)新疆喀什地區(qū)疏附縣石榴冠癭病的發(fā)生危害進(jìn)行了調(diào)查。通過采用病原菌分離、鑒定，并通過快速接種番茄誘導(dǎo)使根莖產(chǎn)生腫瘤等方法，明確了石榴冠癭病的病原菌為Agrobacterium tumefaciens（Smith and Townsend）Conn.。石榴冠癭病是國內(nèi)新發(fā)生的病害，應(yīng)該嚴(yán)格檢疫。

關(guān)鍵詞：石榴；冠癭病；病原菌

中圖分類號(hào)：S665.4；S436.6 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2013.06.015

果樹冠癭?。–rown gall disease）又稱根癌病、根瘤病，是多種果樹共患的一種重要的根部病害。陜西、山西、甘肅、遼寧、河北等省（區(qū)）都有分布，寄主范圍廣泛，主要包括李屬、薔薇屬、蘋果屬、梨屬、胡桃屬、葡萄屬等331屬的640個(gè)不同種植物。感病植物根系出現(xiàn)瘤狀癌變，地上部分生長緩慢，枝條干枯甚至枯死，對(duì)苗木和幼樹影響很大[1-6]。近年來，由于果樹、經(jīng)濟(jì)林木等栽培業(yè)迅速發(fā)展，苗木調(diào)運(yùn)頻繁，此病在新疆有繼續(xù)發(fā)展擴(kuò)大蔓延的趨勢(shì)，是一種急需控制的危險(xiǎn)性病害[7]。

冠癭病是一種細(xì)菌性病害。德國科學(xué)家經(jīng)過多年研究發(fā)現(xiàn)了冠癭病的成病機(jī)理。冠癭病是一種由根瘤農(nóng)桿菌引起的在多種植物中廣泛傳播的病害，患病植物的一些部位，尤其是根莖接合部形成腫瘤狀膨大，造成果樹減產(chǎn)[8]。據(jù)我們調(diào)查，在2009年喀什地區(qū)疏附縣石榴種植區(qū)發(fā)生了石榴冠癭病。經(jīng)查閱文獻(xiàn)，在我國還無人對(duì)石榴冠癭病進(jìn)行過研究的報(bào)道，為此我們于2010年5—10月和2011年5—10月對(duì)喀什石榴冠癭病病害的發(fā)生危害情況及對(duì)病原菌進(jìn)行了分離培養(yǎng)鑒定，為病害的有效治理提供科學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 果園石榴冠癭病發(fā)病率調(diào)查

2010年5—10月、2011年5—10月連續(xù)2年，對(duì)新疆喀什地區(qū)疏附縣石榴基地冠癭病發(fā)生情況，進(jìn)行了專項(xiàng)調(diào)查。

1.2 病原菌的分離、培養(yǎng)、鑒定

1.2.1 供試培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。PDA培養(yǎng)基的成分：馬鈴薯200 g，葡萄糖10～20 g，瓊脂17～20 g，水1 000 mL。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的成分：牛肉膏5 g，氯化鈉5 g，葡萄糖10 g，蛋白胨5 g，瓊脂15 g，水1 000 mL。

1.2.2 分離方法 從果園發(fā)病的果樹枝條瘤狀物處，刮去表皮角質(zhì)層，留取木質(zhì)部以上瘤狀皮層和木質(zhì)部，切取至綠豆大小。經(jīng)處理后的病樣通過以下程序消毒滅菌：75%酒精浸泡5～10 s，取出置5%次氯酸鈉溶液浸泡2 min后，依次在無菌水中清洗3，5，3 min。搗碎皮層組織和木質(zhì)部，分別劃線接種于PDA和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)3 d后純化，觀察其培養(yǎng)特性，再進(jìn)行革蘭氏染色。

1.2.3 純化及革蘭氏染色[9] 將培養(yǎng)出的病原菌接種至鋪好的培養(yǎng)皿中，倒扣放置。待接種程序完成后，把接種好的培養(yǎng)皿放置于25 ℃下的溫箱中培養(yǎng)，3 d后開始記錄生長菌落。將生長出的病原菌涂片固定。在無菌操作條件下，用接種環(huán)挑取少量細(xì)菌于干凈的載玻片上涂布均勻，固定。草酸銨結(jié)晶紫染1 min。自來水沖洗，去掉浮色。用碘-碘化鉀溶液媒染1 min，傾去多余溶液。用中性脫色劑如乙醇（95%）或丙酮酸脫色30 s，油鏡觀察。

1.2.4 病原菌的致病性測(cè)定 選用番茄做為指示植物。在室內(nèi)條件下，用番茄消毒種子培養(yǎng)苗長到8 cm高時(shí)，采用根莖注射的方法用滅菌注射器接種病菌懸液，以接無菌水為對(duì)照，共接種20株，每株3個(gè)接種點(diǎn)，套袋保濕培養(yǎng)24 h后去掉保鮮袋。第3天開始觀察記錄，10 d后統(tǒng)計(jì)腫瘤發(fā)生情況。參考細(xì)菌鑒定方面的資料，結(jié)合接種誘導(dǎo)對(duì)病原菌進(jìn)行鑒定[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 癥狀描述

石榴冠癭病主要危害枝條、根莖部等。在危害部位形成大小不一的瘤狀物，初期幼嫩，質(zhì)地柔軟，逐漸增大成不規(guī)則形狀，其后在大瘤上又出現(xiàn)許多小瘤，表面粗糙并龜裂，顏色發(fā)綠，到后期瘤的內(nèi)部組織紊亂，瘤邊緣長出許多絲狀物（圖1）；得病后的植株生長衰弱，葉黃而且小，新梢生長不良，甚至枯死（圖2）

2.2 病原菌的分離鑒定

分別用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基用稀釋分離法培養(yǎng)[11]，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上主要長出細(xì)菌菌落，5個(gè)培養(yǎng)皿上共長出650個(gè)菌落。在皮層組織中分離出607個(gè)菌落；木質(zhì)部和表皮很少，共分離出43個(gè)菌落。根據(jù)菌落特征將其歸為2種：但以菌株1為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，菌落小而圓，白色，稍突起，濕潤半透明，菌體桿狀，平均大小0.6×2.0 μm，革蘭氏染色反應(yīng)陰性。結(jié)果見表1。

2.3 病原細(xì)菌的致病性測(cè)定

將石榴枝條瘤狀物上分離純化后的菌株1，接種到8 cm高的盆栽番茄幼苗根莖上，誘發(fā)腫瘤迅速形成，再從誘發(fā)的腫瘤上分離出與原先接種的相同菌。結(jié)果見表2。接種組與對(duì)照組有較明顯的差異。

3 結(jié)論與討論

通過對(duì)石榴冠癭病的癥狀觀察，病原分離培養(yǎng)，接種誘導(dǎo)相結(jié)合的方法，確定引起新疆喀什地區(qū)疏附縣石榴冠癭病的病原，是野桿菌屬的根癌土壤桿菌Agrobacterium tumefaciens （Smith and Townsend）Conn，與文獻(xiàn)報(bào)道的果樹冠癭病的致病菌特征相一致。從分離部位來看病，瘤皮層中分離細(xì)菌數(shù)量多，木質(zhì)部和表皮很少。

該病原菌在石榴上的危害在全國尚屬首次報(bào)道，危害性很強(qiáng)，可以導(dǎo)致石榴樹干枯，從而造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，應(yīng)該引起高度重視。石榴產(chǎn)地發(fā)現(xiàn)病株應(yīng)立即挖出集中燒毀。無病區(qū)不宜從病區(qū)引進(jìn)苗木，調(diào)運(yùn)檢疫中發(fā)現(xiàn)病苗應(yīng)該銷毀。對(duì)可疑苗木出圃時(shí)，用硫酸銅浸泡5 min，再用生石灰50倍液浸泡1 min，并用清水沖洗。

對(duì)輕度病株可將病瘤切除，用80%抗菌劑402乳油50倍液消毒，外涂波爾多液保護(hù)?？梢韵×?。

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