談暠媛

摘要：建立了魚肉組織中金霉素、多西環(huán)素、米諾環(huán)素的多殘留檢測的高效液相色譜法（HPLC）。樣品經(jīng)0.1 mol/LEDTA-McIlvaine緩沖液（pH 4.0）提取離心后，上清液用Oasis HLB固相萃取小柱凈化，選用安捷倫Eclipse plus C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，粒徑5μm），以乙腈：甲醇：0.01 mol/L草酸溶液（2﹕1﹕7）為流動相，流速0.5 mL/min，350 nm波長處測定，外標法定量。其3種藥物濃度在25～200 ng/mL時均與峰面積呈良好的線性關系。結果表明，3種目標物質在魚肉組織中的檢測限為25 μg/kg，定量限為50 μg/kg。在不同濃度添加水平下測定，平均回收率在76.5%～89.1%，批內(nèi)、批間變異系數(shù)均在10.00%以內(nèi)。

關鍵詞：金霉素；多西環(huán)素；米諾環(huán)素；多殘留；高效液相色譜法（HPLC）

中圖分類號：TS254.7 文獻標識碼：A 文章編號：1007-273X（2013）06-0017-05

四環(huán)素類（Tetracyclines，TCs）藥物是由放線菌產(chǎn)生的一類廣譜抗生素，對革蘭氏陽性和陰性細菌、立克次氏體等均有很好的抑菌作用，常被用于畜、禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖中[1]。目前國內(nèi)四環(huán)素類抗生素主要包括六種：金霉素、土霉素、四環(huán)素、強力霉素（多西環(huán)素）、美他環(huán)素和米諾環(huán)素。

本文針對3種四環(huán)素類抗生素藥物的特性，研究其在魚肉中的多殘留檢測方法。方法采用高效液相色譜法，其具有選擇性高、分離效果好、檢測靈敏度高等優(yōu)點，其準確度和回收率均能滿足國家規(guī)定的對四環(huán)素類藥物殘留限量的要求，具有較好的通用性和推廣性。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

Waters2695高效液相色譜儀 （配2487型紫外檢測器）；分析天平；回旋振蕩器；旋渦混合器；數(shù)顯恒溫水浴鍋；高速冷凍離心機；氮吹儀；Waters Oasis HLB固相萃取小柱（60 mg，3 mL）

1.2 藥品與試劑

金霉素（CTC）、多西環(huán)素（DC）、米諾環(huán)素（MINO）標準品含量均大于80.0%。草酸、無水磷酸氫二鈉、檸檬酸、乙二胺四醋酸二鈉均為分析純；甲醇、乙腈均為色譜純；水為重蒸餾水。

1.3 溶液的配制

標準儲備液的配制：分別精密稱取金霉素、多西環(huán)素、米諾環(huán)素的標準品10.00 mg，用適量甲醇溶解，定容至10 mL容量瓶，配成濃度為1 mg/mL的標準儲備溶液，置于0 ℃冰箱中冷藏避光保存。保存期為1個月。

混合標準工作液的配制：用流動相稀釋成適當濃度的標準工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

0.01 mol/L草酸水溶液的配制：稱取草酸1.26 g，加水溶解，稀釋到1 000 mL。

0.1 mol/LNa2EDTA-Mcllvaine緩沖液（pH4.0）的配制：稱取無水磷酸氫二鈉28.4 g，加水溶解，稀釋到1 000 mL。稱取檸檬酸21.0 g，加水溶解，稀釋到1 000mL。將上述磷酸氫二鈉溶液625 mL和檸檬酸溶液1 000mL混合，加入乙二胺四醋酸二鈉60.5 g，使其溶解，搖勻。必要時，用0.1 mol/L鹽酸溶液或0.1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至4.0±0.05。

洗脫液（0.01 mol/L草酸-甲醇溶液）的配制：稱取草酸1.26 g，加甲醇溶解，稀釋到1 000 mL。

1.4 試驗方法

1.4.1 色譜條件 色譜柱∶ 安捷倫Eclipse plus C18：250 mm×4.6 mm，粒徑5 μm；流動相∶乙腈∶甲醇∶ 0.01mol/L草酸溶液（用1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH至2.5）=2∶1∶7；流速：0.5 mL/min；進樣量：50 μL；柱溫：25 ℃；檢測波長：350 nm。

1.4.2 標準曲線的繪制 準確量取適量的標準儲備液，用流動相分別稀釋成25、50 、100 、200 、500 、1 000 ng/mL的標準工作液，供儀器分析，每個濃度重復檢測兩次，取其平均峰面積值為縱坐標，再分別以金霉素、多西環(huán)素和米諾環(huán)素的濃度為橫坐標，繪制標準曲線，擬合，求標準曲線方程和相關系數(shù)。

1.4.3 樣品的提取和凈化 稱?。?.00 ±0.05）g試樣，置于50 mL塑料離心管中，加入0.1 mol/LNa2EDTA-Mcllvaine緩沖液（pH 4.0）15 mL，渦旋混勻1 min，用回旋振蕩器振蕩20 min后，15 ℃，6 000 r/min離心10 min，上清液轉移到另一潔凈50 mL塑料離心管中，在殘渣中再加入0.1 mol/LNa2EDTA-Mcllvaine緩沖液10 mL重復提取一次，渦旋混勻1 min，15 ℃，6 000 r/min離心10 min，合并兩次上清液，渦旋混勻，6 000 r/min離心10 min，上清液轉移至另一潔凈50 mL塑料離心管，備用。

Oasis HLB固相萃取小柱依次用5 mL甲醇，5 mL水活化。取上述備用提取液10 mL過柱，調(diào)節(jié)流速小于1 mL/min，待樣液完全流出后用5 mL水淋洗，擠干。用3 mL 0.01mol/L草酸-甲醇溶液洗脫，擠干，將收集的洗脫下來的溶液置于40 ～45 ℃水浴下氮氣吹干，用流動相2 mL溶解殘余物，渦旋混勻1 min后經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，濾液供高效液相色譜檢測。

2 結果

2.1 線性關系

結果表明，在濃度為25～200 ng/mL的范圍內(nèi)，金霉素、多西環(huán)素和米諾環(huán)素的峰面積與其濃度呈良好的線性關系。

（1）CTC： y=1.09e+002x-6.36e+002 r=0.999 8；

（2）DC： y=1.66e+002x-9.69e+002 r=0.999 6；

（3）MINO： y=1.91e+002x-4.54e+002 r=0.999 9

2.2 方法的檢測限和定量限

本方法在金霉素、多西環(huán)素及米諾環(huán)素的加標量為25 μg/kg時，經(jīng)提取后測定，3種四環(huán)素類藥物的信噪比S/N大于3；在加標量為50 μg/kg時，其信噪比S/N大于10，回收率均大于80.0%。故最終確定該方法的檢測限為25 μg/kg，定量限為50 μg/kg，低于國家規(guī)定的四環(huán)素類抗生素的最高殘留限量100 μg/kg。結果表明，該方法滿足殘留分析的要求，具有可行性。

2.3 方法的回收率、精密度及空白試驗

確定檢測方法后，分別以陰性的鳙魚為空白樣品，通過人為添加一定濃度的標準品，檢測其方法的回收率。試驗中分別在樣品[每份（5.00±0.05） g]中添加0.250、0.500、1.000 μg的金霉素、多西環(huán)素和米諾環(huán)素進行回收試驗，添加濃度分別相當于50 、100 、200 μg/kg，平行樣共5份，同時考察了其日內(nèi)精密度，其試驗結果見表1、表2、表3。其日間精密度是采用100 μg/kg的加標濃量測定其回收率，每日測定一次，連續(xù)測定4 d，其結果見表4。

從表1、表2、表3可知，3種不同添加濃度的樣品回收率在76.5%～89.1%，相對標準偏差均在10.0%以內(nèi)。批內(nèi)及批間變異系數(shù)均在10.00%以下。由表4可見，3種藥物在100 μg/kg的加標濃度下，其回收率在79.9%～90.2%，相對標準偏差在10%以內(nèi)。

空白試驗：用陰性的魚肉組織作為空白樣品，按相同的方法進行試驗，其測定結果表明，在與對照品中3種藥物相應的保留時間里，空白樣品對待測的目標藥物無干擾。

3 分析

3.1 液相色譜分析條件的確定

3.1.1 色譜柱的選擇 本試驗先后試過幾種不同品牌的色譜柱，結果表明，普通的C18色譜柱均可以將金霉素、多西環(huán)素和米諾環(huán)素較好地分離，只是在出峰時間、峰形以及峰面積上稍有不同，只要對流動相的成分比例做輕微的調(diào)整，均能使3種四環(huán)素類抗生素得到理想的分離。故本文最終選擇了安捷倫Eclipse plus C18色譜柱。

3.1.2 檢測波長的確定 四環(huán)素類藥物的分子結構上帶有兩個發(fā)色團，在近可見光區(qū)有強烈的紫外吸收性質。經(jīng)過對3種四環(huán)素類藥物分別進行波長掃描并反復試用后，發(fā)現(xiàn)雖然270 nm波長處紫外有最大吸收，但檢測基線干擾較大，峰型對稱性較差，拖尾較嚴重，最終確定檢測波長為350 nm。

3.1.3 流動相的選擇

（1）流動相成分的選擇。由于四環(huán)素類抗生素具有酸堿兩種性質，且其在堿性環(huán)境中會處于一種不穩(wěn)定的狀態(tài)，在中性環(huán)境下又會和多種金屬離子產(chǎn)生螯合物。而這種金屬螯合物對反相色譜柱有吸附的作用，影響峰形的對稱性，產(chǎn)生拖尾峰，所以一般常在其流動相中加入如EDTA、磷酸和草酸等有機酸[1]。

對其峰形和分離度進行綜合考慮，以乙腈∶甲醇∶0.01 mol/L草酸溶液為流動相時，樣品基質的雜質干擾峰較小，響應值較高，無明顯拖尾現(xiàn)象。

（2）流動相pH對試驗的影響。流動相的pH對試驗有很大的影響。試驗發(fā)現(xiàn)，0.01 mol/L的草酸溶液pH約為2.0時，對CTC、DC、MINO 3種藥物的分離度均為3.0以上，較為理想，但是米諾環(huán)素的出峰時間較早，約為4.0 min左右，容易與樣品基質中的雜質干擾峰混在一起，影響其定量檢測的準確性。當pH大于3.5時，金霉素和多西環(huán)素的保留時間很接近，分離度達不到要求，且同時3種藥物峰形也受到很大的影響，理論塔板數(shù)迅速下降，且出現(xiàn)嚴重拖尾現(xiàn)象，金霉素和多西環(huán)素的響應很低，影響了其檢測的靈敏度。

經(jīng)反復試驗，發(fā)現(xiàn)當草酸水溶液的pH為2.5時，3種目標藥物峰能和雜質峰很好地分離，保留時間適中，峰形較好，且無明顯拖尾現(xiàn)象。

（3） 流動相配比對試驗的影響。米諾環(huán)素因容量因子最小，出峰時間最早，容易與樣品基質中的雜質干擾峰重疊，對其定量檢測造成影響；但是有機相的比例太低又會引起出峰時間太晚，產(chǎn)生拖尾，降低檢測靈敏度，而多西環(huán)素的容量因子是待測的3種藥物中最大的，出峰時間最晚，拖尾最為嚴重[2]。試驗采用了3種不同的比例∶乙腈∶甲醇∶0.01mol/L草酸溶液分別為=4∶2∶4； 2∶1∶8； 2∶1∶7，經(jīng)過反復對比，發(fā)現(xiàn)最后一種比例對3種物質的分離度、峰形、靈敏度和保留時間等最為合適。

3.2 樣品前處理方法的確定

3.2.1 提取溶劑的選擇 在生物組織中，四環(huán)素類藥物極易與蛋白質結合，需使用酸性溶液使其脫蛋白，從中提取待測的四環(huán)素類抗生素。但是酸性太強（pH<2.0）會導致四環(huán)素類抗生素降解生成脫水產(chǎn)物，且加熱時會轉變成差向異構體。所以提取液必須選用弱酸性溶液[2-5]。在本試驗中分別用0.1 mol/LNa2EDTA-Mcllvaine緩沖液（pH4.0）、Mcllvaine緩沖液、5%高氯酸、5%三氯乙酸4種不同的提取液對添加了1 μg/g藥物的魚肉組織進行提取（依次使用15mL、10mL提取），測定3種藥物的平均回收率。結果表明，0.1mol/LNa2EDTA-Mcllvaine緩沖液（pH4.0）的綜合提取效率最好。

3.2.2 樣品的凈化

（1）固相萃取小柱的選擇。Oasis HLB固相萃取小柱是一種親水親脂平衡的水可清潤性反向吸附型萃取柱，對極性化合物有良好的保留能力，其可耐受廣泛的pH范圍和溶劑，保留藥物的容量也比一般的傳統(tǒng)硅膠基質填充的萃取小柱要高3倍。

四環(huán)素類藥物的凈化一般采用Oasis HLB柱和C18固相萃取小柱。為了比較哪種萃取小柱對四環(huán)素類藥物的回收率最好，做了一個試驗性實驗。處理添加待測藥物的樣品（添加量100 ng/g），使其同時過Waters Oasis HLB（60 mg，3 mL）和Agilent C18（500 mg，3 mL）兩種萃取小柱，比較其回收率及凈化效果。結果表明，Waters Oasis HLB柱效果較好，回收率高，雜質干擾少。

（2）淋洗液的選擇。在樣品溶液全部過柱后，除了金霉素、多西環(huán)素、米諾環(huán)素3種目標待測物附著在HLB萃取柱的吸附床上外，還有一些化學結構和極性相似的雜質和其他抗生素可能也附著在上面，所以需要用淋洗液進行淋洗，用于去除小柱吸附床上的大部分雜質，對樣品進一步凈化，本文中分別用5 mL的水、2%甲醇/水、5%甲醇/水、8%甲醇/水進行淋洗后，將淋洗液收集，檢測其金霉素、多西環(huán)素及米諾環(huán)素的含量。結果發(fā)現(xiàn)，除了用8%甲醇/水作為淋洗液的洗滌液中含少量的待測物質外，其他的洗滌液中均檢測不出目標物質。由于前3種淋洗液的效果差不多，為了使操作簡便化，最終采用5 mL水作為淋洗液。

（3）洗脫液的選擇。反向萃取柱一般使用甲醇、乙酸乙酯、正己烷、異丙醇等有機溶劑作為洗脫液。根據(jù)四環(huán)素類藥物的性質，按照理論，甲醇、0.01 mol/L草酸甲醇和流動相均可以將其洗脫下來。有資料顯示為了克服四環(huán)素類抗生素不穩(wěn)定以及易與共萃物難分開等問題，可在淋洗液中加入草酸以提高其回收率和改善凈化結果。試驗中將添加濃度為100 ng/g的樣品處理后，過Oasis HLB萃取小柱，用甲醇、0.01 mol/L草酸甲醇溶液和流動相分別作為洗脫液處理樣品，洗脫液體積為3 mL，前兩種洗脫后，在40～45 ℃水浴下氮氣吹干，用流動相2 mL溶解殘余物，過濾后檢測；后一種洗脫后直接過濾檢測。結果表明，采用0.01 mol/L草酸甲醇溶液作為洗脫液回收率高，雜質干擾較少，效果最優(yōu)。

4 小結與討論

本研究通過反復試驗建立了檢測魚肉中金霉素、多西環(huán)素、米諾環(huán)素的多殘留量的高效液相色譜法，確定了高效液相色譜檢測條件：色譜柱為安捷倫Eclipse plus C18柱，250 mm×4.6 mm，粒徑5 μm，或相當者；流動相為乙腈∶甲醇∶0.01 mol/L草酸溶液（用1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH至2.5）=2∶1∶7，等梯度洗脫；流速為0.5 mL/min；檢測波長為350 nm；進樣量為50 μL；柱溫為25 ℃。

方法中對樣品的提取凈化過程進行了優(yōu)化，采用0.1 mol/LNa2EDTA-Mcllvaine緩沖液（pH 4.0）提取樣品中的待測藥物，用Oasis HLB固相萃取小柱凈化，其操作簡單，雜質較少，提取效果好，回收效率高。

結果顯示3種目標藥物的線性范圍為25～200 ng/m L。通過加標樣品的測定結果，確定了該方法中金霉素、多西環(huán)素、米諾環(huán)素的檢測限為25 μg/kg，定量限為50 μg/kg。其回收率在76.5%～89.1%，批內(nèi)及批間變異系數(shù)均小于10.00%。

該檢測方法較現(xiàn)有的檢測四環(huán)素類藥物的方法創(chuàng)新之處在于：使用等梯度洗脫檢測魚肉組織中米諾環(huán)素、金霉素和多西環(huán)素的多殘留檢測；將流動相中的0.0 1mol/L的草酸溶液的pH調(diào)至2.5；使用0.01 mol/L草酸甲醇作為洗脫液，氮氣吹干后使用流動相復溶。結果表明，此方法能達到較好的回收效果，證實了其適用性。

試驗中檢測的是魚肉組織，今后在相關試驗中還可以嘗試選用其他可食性動物組織進行檢測，擴寬其適用范圍。本文中檢測的只有3種四環(huán)素類抗生素，在今后的研究中可嘗試通過調(diào)整高效液相色譜條件和改進樣品處理方法來檢測更多種類的四環(huán)素類藥物。

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