梁利妹 胡深 董文婷 馮超林

摘要：建立了畜產(chǎn)品包括生鮮乳、禽蛋、禽肉中三聚氰胺殘留檢測的反相高效液相色譜方法。樣品經(jīng)1%的三氯乙酸提取，飽和乙酸鉛沉淀蛋白。經(jīng)固相萃取柱MCX凈化，于高效液相色譜儀紫外法測定，外標(biāo)法定量。三聚氰胺在0.2～20.0μg/mL 范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)為0.999 8 。在 0.2～1.0 mg/kg濃度范圍內(nèi)，平均加標(biāo)回收率在 70%以上，批內(nèi)變異系數(shù)在10%以內(nèi)，批間變異系數(shù)在15%以內(nèi)。方法的檢出限為0.05 mg/kg ，定量限為0.10mg/kg 。該方法定量限低，回收率高，可以同時測定多種樣品，方便省時，滿足農(nóng)產(chǎn)品檢驗(yàn)工作的需要。

關(guān)鍵詞：三聚氰胺；畜產(chǎn)品；高效液相色譜法（HPLC）；MCX固相萃取柱

中圖分類號：TS252.7 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1007-273X（2013）06-0011-04

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 試劑與材料 除非另有說明，所有試劑均為分析純，水為millipore超純水。甲醇（色譜純）；氨水（含量為25%～28%）；三氯乙酸；檸檬酸；庚烷磺酸鈉（色譜純 ）；乙酸鉛；Waters MCX固相萃取柱（60 mg，3 mL）； 濾膜（0.45 μm，有機(jī)相）；氮?dú)猓兌却笥诘扔?9.999% ）；三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品（純度>99%）。

1.1.2 儀器與設(shè)備 高效液相色譜儀（waters2695）配有紫外檢測器；離心機(jī)；超聲提取器；旋渦混合器；震蕩搖床；固相萃取裝置；氮吹儀；分析天平（感量為0.000 01 g和0.01 g）。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確稱取100.0 mg（精確到0.1 mg）三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL 容量瓶中，用50%甲醇水溶液溶解并定容至刻度，配制成濃度為1 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于4 ℃避光保存。有效期3個月。

準(zhǔn)確移取20.00 mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于100 mL 容量瓶中，用50%甲醇水溶液溶解并定容至刻度，配制成濃度為0.2 mg/mL 的稀釋液。用流動相逐級稀釋得到濃度為0.2、0.5、1、2、5、10、20 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，濃度由低到高進(jìn)樣檢測以峰面積-濃度作圖得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。

1.2.2 三聚氰胺樣品前處理 ①稱取樣品5.00 g（精確至0.01 g）試樣于50 mL具塞塑料離心管中，加入20 mL 1%三氯乙酸溶液和1 mL飽和乙酸鉛，超聲提取10 min，再振蕩提取10 min后，以不低于10 000 r/min離心5 min，上清液待凈化。②依次用3 mL 甲醇、3 mL 水活化MCX固相萃取柱 ，將待凈化液轉(zhuǎn)移至固相萃取柱中，依次用3 mL水和3 mL甲醇洗滌，抽至近干后。③用5 mL5%氨化甲醇溶液洗脫，用試管收集洗脫液。整個固相萃取過程流速不超過1 mL/min。④洗脫液于50 ℃下用氮?dú)獯蹈伞＂輾埩粑镉? mL流動相定容，渦旋混合1 min，過0.45 μm微孔濾膜后，供HPLC測定。

1.2.3 定量限和檢測限的測定 最低檢測限和最低定量限的確定，是根據(jù)信噪比（S/N）的值來確定的。稱取6份空白組織，按照“1.2.2”步驟處理后，測得基線噪音值，求其平均值。

按照信信噪比S/N=3時相對的添加濃度為檢測限，S/N=10時相對的添加濃度為定量限。

1.2.4 添加回收率和精密度測定 稱取試樣（5±0.05） g于50 mL離心管中，加入適量標(biāo)準(zhǔn)貯備液，使其各農(nóng)產(chǎn)品添加濃度分別為0.1、0.2、1.0 μg/kg，每個添加濃度設(shè)5個平行，按照1.2.2項(xiàng)下步驟操作進(jìn)行測定，根據(jù)峰面積計(jì)算添加回收率和批間、批內(nèi)變異系數(shù)。

1.2.3 高效液相色譜測定 HPLC參考條件： ①色譜柱 C18柱，250 mm×4.6 mm，粒度5 μm，或相當(dāng)者。②流動相：離子對試劑緩沖液（準(zhǔn)確稱取2.10 g 檸檬酸和2.02 g 庚烷磺酸鈉于1 L容量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度）-乙腈（90+10，V/V），混勻。③流速：1.0 mL/min。④柱溫：40℃。⑤波長：240 nm。⑥進(jìn)樣量：20 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系

在濃度為0.2～20.0 μg /mL的范圍內(nèi)，三聚氰胺的峰面積與其濃度呈線性相關(guān)，見表1。

2.2 檢測限和定量限

根據(jù)6個空白組織的基線噪音平均值，按信噪比S/N=3為檢測限，S/N=10為定量限，求得在生鮮乳、禽蛋、禽肉中檢測限為0.05 mg/kg，定量限為0.10 mg/kg。

2.3 添加回收率和精密度

在生鮮乳、禽蛋、禽肉中添加濃度為0.1、0.2、1.0 μg/kg的三聚氰胺，進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，各產(chǎn)品的平均回收率在70%以上，批內(nèi)變異系數(shù)在10%以內(nèi)，批間變異系數(shù)在15%以內(nèi)。結(jié)果見表2～表6。

3 結(jié)論

建立了農(nóng)產(chǎn)品包括生鮮乳、禽蛋、禽肉中三聚氰胺殘留檢測的反相高效液相色譜方法。樣品經(jīng)1%的三氯乙酸提取，飽和乙酸鉛沉淀蛋白。經(jīng)固相萃取柱MCX凈化，于高效液相色譜儀紫外法測定，外標(biāo)法定量。三聚氰胺在0.2～20.0 μg/mL 范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)為0.999 8 。在 0.1～1.0 mg/kg濃度范圍內(nèi)，平均加標(biāo)回收率在70%以上，批內(nèi)變異系數(shù)在10%以內(nèi)，批間變異系數(shù)在15%以內(nèi)。方法的檢出限為0.05 mg/kg ，定量限為0.10 mg/kg。該方法定量限低，回收率高，可以同時測定多種樣品，方便省時，滿足農(nóng)產(chǎn)品檢驗(yàn)工作的需要。