陳劍鋒　李克克　王承恩等

摘要：以臭馬比木（Nothapodytes nimmoniana）帶芽莖段作外植體進(jìn)行離體培養(yǎng)，研究了不同基本培養(yǎng)基和激素濃度對其側(cè)芽萌發(fā)的影響。結(jié)果表明，基本培養(yǎng)基類型對臭馬比木莖段外植體帶芽莖段的萌發(fā)有極顯著影響，以WPM作為基本培養(yǎng)基，側(cè)芽萌發(fā)率和增殖系數(shù)極顯著高于MS和B5培養(yǎng)基。正交試驗(yàn)結(jié)果顯示W(wǎng)PM+0.5 mg/L TDZ+1.5 mg/L 6-BA最適于臭馬比木莖段的離體培養(yǎng)，側(cè)芽萌發(fā)率和增殖系數(shù)分別為96.8%和1.14。

關(guān)鍵詞：臭馬比木（Nothapodytes nimmoniana）；莖段；離體培養(yǎng)

中圖分類號：S567.1+9；S339.4+1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）07-1692-03

臭馬比木（Nothapodytes nimmoniana （Graham） Mablerley）又名青脆枝，屬茶茱萸科假柴龍樹屬（Nothapodytes sp.）多年生植物，原產(chǎn)于我國臺灣蘭嶼。臭馬比木全株均含喜樹堿，且含量遠(yuǎn)高于喜樹，是提取抗癌藥物喜樹堿的優(yōu)質(zhì)原料[1]。喜樹堿及其系列衍生物對胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌等十多種癌癥均有特殊療效，已成為抗腫瘤藥物的主要品種[2]。喜樹堿需求量的不斷增加導(dǎo)致喜樹堿原材料資源面臨枯竭的危險(xiǎn)，臭馬比木的野生資源也大幅減少，在一些國家已被列為敏感物種[3]。臭馬比木以種子繁殖為主，產(chǎn)苗量低且成株時(shí)間長，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足市場的需求。因此，利用組織培養(yǎng)技術(shù)快速繁育臭馬比木，并在培養(yǎng)過程中利用技術(shù)手段增加組培苗中的喜樹堿含量，對合理有效利用資源、提供優(yōu)質(zhì)的喜樹堿提取原料具有重要意義[4-6]。本研究以臭馬比木的帶芽莖段為外植體進(jìn)行離體培養(yǎng)，初步建立離體快繁技術(shù)，旨在為臭馬比木的快速繁殖、優(yōu)良品種的保存及工廠化生產(chǎn)提供相關(guān)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 臭馬比木外植體的接種

實(shí)驗(yàn)用臭馬比木材料取自仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院鐘村種質(zhì)資源圃，為兩年生植株，取健壯無病蟲害枝條，洗凈后剪取帶有1～2個(gè)側(cè)芽的莖段作為外植體，流水清洗1 h以上，用體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇表面滅菌10 s，無菌水漂洗2～3次后用1 g/L HgCl2溶液滅菌15 min，再用無菌水漂洗3～5次，將消毒后的莖段隨機(jī)接種在培養(yǎng)基上，培養(yǎng)條件為溫度（25±2）℃、光照度1 600 lx、光照時(shí)間16 h/d。

1.2 基本培養(yǎng)基對臭馬比木側(cè)芽萌發(fā)率和增殖系數(shù)的影響

分別以MS、WPM及B5為基本培養(yǎng)基，均添加7 g/L瓊脂、30 g/L蔗糖、0.05 mg/L TDZ和0.1 mg/L 6-BA，pH 6.0，每處理接種50個(gè)外植體（帶有70個(gè)側(cè)芽），重復(fù)3次。接種30 d后統(tǒng)計(jì)外植體存活率、側(cè)芽萌發(fā)率及增殖系數(shù)。

存活率=存活外植體個(gè)數(shù)/接種的外植體總數(shù)×100%

萌發(fā)率=萌發(fā)側(cè)芽的外植體個(gè)數(shù)/存活的外植體個(gè)數(shù)×100%

增殖系數(shù)=萌發(fā)的側(cè)芽個(gè)數(shù)/存活的外植體個(gè)數(shù)

1.3 正交試驗(yàn)

采用三因素三水平正交設(shè)計(jì)[7]考察基本培養(yǎng)基類型、TDZ濃度和6-BA濃度對外植體側(cè)芽萌發(fā)率和增殖系數(shù)的影響，因素與水平見表1，正交試驗(yàn)每處理接種50個(gè)外植體（帶有70個(gè)側(cè)芽），30 d后統(tǒng)計(jì)側(cè)芽萌發(fā)率和增殖系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基對臭馬比木側(cè)芽萌發(fā)的影響

分別以MS、WPM及B5為基本培養(yǎng)基，臭馬比木帶芽莖段外植體接種15～25 d后側(cè)芽即開始萌動，30 d后各培養(yǎng)基中外植體存活及側(cè)芽萌發(fā)的情況見表2。從表2可以看出，基本培養(yǎng)基類型對外植體存活率的影響不大，各處理差異不顯著（P>0.05），但對莖段側(cè)芽的萌發(fā)率和增殖系數(shù)有較大影響，WPM作基本培養(yǎng)基時(shí)側(cè)芽萌發(fā)率和增殖系數(shù)均極顯著高于MS和B5基本培養(yǎng)基（P<0.01），且芽苗健壯，長勢良好（圖1A）。MS作基本培養(yǎng)基時(shí)萌發(fā)的芽苗葉片薄而發(fā)黃，苗生長細(xì)弱，伸長不明顯（圖1B）；B5作基本培養(yǎng)基時(shí)側(cè)芽萌動較慢，30 d時(shí)芽苗生長不明顯（圖1C）。且培養(yǎng)后期MS和B5培養(yǎng)基中均出現(xiàn)了不同程度的褐化現(xiàn)象。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果見表3。從表3可以看出，各因素中基本培養(yǎng)基類型對莖段側(cè)芽萌發(fā)率和增殖系數(shù)的影響最大，其次是TDZ濃度，6-BA濃度對莖段離體培養(yǎng)的影響最小。方差分析表明，基本培養(yǎng)基類型對莖段側(cè)芽萌發(fā)率和增殖系數(shù)的影響達(dá)極顯著水平，TDZ濃度對莖段側(cè)芽萌發(fā)率和增殖系數(shù)的影響達(dá)顯著水平，6-BA濃度對莖段側(cè)芽萌發(fā)率和增殖系數(shù)的影響不顯著。最佳培養(yǎng)條件組合為A2B3C1，即以WPM為基本培養(yǎng)基，附加0.5 mg/L TDZ 和1.5 mg/L 6-BA，此條件下側(cè)芽萌發(fā)率為96.8%，增殖系數(shù)為1.14，均高于其他正交試驗(yàn)組合的結(jié)果。取莖段外植體接種于該培養(yǎng)基中，側(cè)芽萌發(fā)和生長情況見圖2，可見芽苗生長健壯、長勢良好。

3 小結(jié)與討論

木本植物由于本身的特點(diǎn)，組織培養(yǎng)通常很難實(shí)現(xiàn)脫分化，本身易出現(xiàn)褐化、生根難、培養(yǎng)周期長等問題[8]，同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)木本植物的愈傷組織和胚狀體的誘導(dǎo)較為困難，且許多研究結(jié)果不一致，難以形成定論[9]。以莖段為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，經(jīng)短時(shí)間直接分化出芽是一條有效的快速繁殖途徑[10]。組織培養(yǎng)的成功與否與培養(yǎng)基類型有很大關(guān)系，不同基本培養(yǎng)基中無機(jī)離子、有機(jī)營養(yǎng)物質(zhì)含量各異，這些均是組織培養(yǎng)中外植體賴以生存和生長的基礎(chǔ)[11]。臭馬比木離體莖段組織培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基的類型和激素種類及配比是影響側(cè)芽萌發(fā)和生長的關(guān)鍵因素。本實(shí)驗(yàn)對MS、B5、WPM 3種基本培養(yǎng)基進(jìn)行了篩選，發(fā)現(xiàn)臭馬比木離體莖段側(cè)芽在WPM培養(yǎng)基中的萌發(fā)率遠(yuǎn)高于MS、B5培養(yǎng)基，這與紅豆杉[12]、喜樹[13]、銀杏[14]等的研究結(jié)果一致。3種培養(yǎng)基中WPM培養(yǎng)基中的NH4+與NO3-濃度之比為1∶1，而MS和B5培養(yǎng)基中的NO3-濃度均高于NH4+。臭馬比木離體莖段在MS、B5培養(yǎng)基中褐化明顯，這是否與培養(yǎng)基中離子濃度和N源濃度高有關(guān)還需進(jìn)一步研究[11]。

植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)是培養(yǎng)基中的關(guān)鍵物質(zhì)，雖用量極小，但在組織培養(yǎng)中起著重要的作用。基本培養(yǎng)基只能保證外植體的生存與最低的生理活動，只有加入適當(dāng)?shù)闹参锷L調(diào)節(jié)劑后才能誘導(dǎo)細(xì)胞分裂的啟動、愈傷組織的形成以及根、芽的分化[15，16]。不同功能激素的配比是影響外植體成功啟動的重要因子，組織培養(yǎng)中常用細(xì)胞分裂素和生長素的組合作為生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，但由于外植體本身內(nèi)源激素水平的差異，在添加外源調(diào)節(jié)劑時(shí)要對外源調(diào)節(jié)劑的種類和濃度加以選擇和優(yōu)化。本實(shí)驗(yàn)在預(yù)實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，6-BA與TDZ的組合更有利于臭馬比木莖段側(cè)芽的萌發(fā)，正交試驗(yàn)結(jié)果表明WPM+1.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L TDZ更適于臭馬比木莖段側(cè)芽的萌發(fā)。培養(yǎng)基的組成成分不同，對植物細(xì)胞的生長及次生代謝物的產(chǎn)生也有較大的影響，在實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的培養(yǎng)基中對臭馬比木莖段進(jìn)行離體培養(yǎng)，是否有利于臭馬比木植株中喜樹堿含量的提高還有待進(jìn)一步的研究[17]。

參考文獻(xiàn)：

[1] 王玲麗，劉文哲.不同種源喜樹幼枝中喜樹堿的含量[J]. 植物學(xué)通報(bào)，2005，22（5）：584-589.

[2] 李春杰，谷 瑩，韓應(yīng)許，等. 喜樹堿及其衍生物的研究進(jìn)展[J]. 中國藥物化學(xué)雜志，2003，13（5）：306-310.

[3] PADMANABHA B， CHANDRASHEKAR M， RAMESHA B， et al. Patterns of accumulation of camptothecin， an anti-cancer alkaloid in Nothapodytes nimmoniana Graham.， in the Western Ghats， India： Implications for identifying high-yielding sources of the alkaloid[J]. Current Science，2006，90（1）：95-100.

[4] 潘學(xué)武，董妍玲，董玉良，等.假柴龍樹屬植物資源的開發(fā)利用與喜樹堿及類似物的生產(chǎn)綜述[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2010（15）：242-243，248.

[5] 方力為.青脆枝快繁及抗癌有效成分分析[J].浙江林業(yè)科技，2008， 28（6）：47-49.

[6] 朱俐蒔.青脆枝及銀杏藥用植物增殖系統(tǒng)之建立[D].臺灣臺中：國立中興大學(xué)，2009.

[7] 陳 魁.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析[M].第二版.北京：清華大學(xué)出版社，2005.

[8] 曹孜義，劉國民.實(shí)用植物組織培養(yǎng)技術(shù)教程[M]. 蘭州：甘肅科學(xué)技術(shù)出版社，1999.

[9] 張紅曉，經(jīng)劍穎.木本植物組織培養(yǎng)技術(shù)研究進(jìn)展[J].河南科技大學(xué)學(xué)報(bào)（農(nóng)學(xué)版），2003，23（3）：66-69.

[10] 胡冬南，上官新晨，劉亮英，等.青錢柳莖段離體培養(yǎng)研究[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，48（6）：1300-1303.

[11] 王 博，范桂枝，詹亞光.不同培養(yǎng)基類型和植物生長調(diào)節(jié)劑配比對白樺愈傷組織中三萜積累的影響[J].林業(yè)科學(xué)，2008，44（10）：153-158.

[12] 金貞蘭，劉繼生，魯京蘭，等. 不同培養(yǎng)基對東北紅豆杉愈傷組織誘導(dǎo)的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（19）：9993-9994. 9997.

[13] 楊國崢.喜樹高效再生體系的建立與農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化研究[D].貴陽：貴州大學(xué)，2007.

[14] 周宏祈. 喜樹組織培養(yǎng)與喜樹堿誘導(dǎo)之研究[D].臺北：國立臺灣大學(xué)，2005.

[15] 朱大保.國外楊樹組培微繁技術(shù)的進(jìn)展[J].北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1990，12（1）：84-91.

[16] 薛建平，劉 俊，蔣細(xì)旺. 藥用植物生物技術(shù)[M].合肥：中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)出版社，2005.

[17] 甘煩遠(yuǎn)，鄭光植. 紅花愈傷組織的誘導(dǎo)、生長及其α-生育酚的產(chǎn)生[J].云南植物研究，1991，13（2）：189-195.