李偉　吳檳

摘要：通過(guò)從耕地土壤中篩選分離野生產(chǎn)漆酶菌株，通過(guò)顯微及菌落形態(tài)觀(guān)察進(jìn)行鑒定，并對(duì)高產(chǎn)菌株進(jìn)行定性定量及定性測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示白腐菌具有較好的產(chǎn)酶特性。

關(guān)鍵詞：漆酶 白腐菌 性能測(cè)定

中圖分類(lèi)號(hào)：TQ925 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1672-5336（2013）14-0050-02

食品中漆酶是一種金屬糖蛋白，屬于多銅氧化酶家族，它分布于動(dòng)物、植物、真菌、細(xì)菌當(dāng)中，其中最主要的是擔(dān)子菌亞門(mén)的白腐真菌。但由于白腐真菌好氧，生長(zhǎng)速度慢，產(chǎn)酶周期長(zhǎng)等特點(diǎn)，發(fā)酵條件比較苛刻，限制了白腐真菌漆酶的工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用。

1 主要原料與試劑

1.1 主要原料

LB固體培養(yǎng)基、改良高氏一號(hào)固體培養(yǎng)基、PDA固體培養(yǎng)基、產(chǎn)酶培養(yǎng)基[3]葡萄糖、冰乙酸、乙酸鈉、乙醇、氫氧化鈉、蛋白胨、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、氯化鈣均為分析純。

1.2 儀器設(shè)備

高低溫恒溫振蕩培養(yǎng)箱HZQ-F160A型：上海-恒科技有限公司；pH計(jì)：pH計(jì)上海精密科學(xué)儀器有限公司；可見(jiàn)紫外分光光度計(jì)：SP-72上海光譜儀器有限公司；顯微鏡：BA200 Motic；電子天平ALC-2100上海精密儀器儀表有限公司。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1 從土壤中篩選分離微生物

從4℃冰箱中取出從長(zhǎng)白山、大興安嶺、饒河、伊春、佳木斯等地采集的土壤樣品，無(wú)菌條件下分別用蒸餾水沖洗后，得到的含菌水。各取1mL于裝有9mL生理鹽水的試管中，振蕩10min，靜置5min，即成10-1稀釋度的樣品溶液。

梯度稀釋法分離：取1mL10-1的稀釋樣品加入裝有9mL無(wú)菌生理鹽水的試管，混勻，即成10-2的稀釋溶液，按此法制備10-3的稀釋溶液。去每個(gè)梯度的稀釋溶液各200μL，分別涂于LB固體培養(yǎng)基、改良高氏一號(hào)固體培養(yǎng)基和PDA固體培養(yǎng)基平板上，其中LB固體培養(yǎng)基分為：pH3.0、pH7.0、pH10.0，即9個(gè)平板，改良高氏一號(hào)固體培養(yǎng)基分為：pH5.0、pH8.0、pH12.0即9個(gè)平板，PDA固體培養(yǎng)基分為：pH5.0、pH6.0、pH12.0，即9個(gè)平板，共計(jì)27個(gè)平板。于30℃恒溫箱培養(yǎng)5天，同時(shí)每天做好酶活檢測(cè)。

待長(zhǎng)出菌落后，無(wú)菌條件下將形態(tài)差異的菌落接種至相應(yīng)pH的發(fā)酵培養(yǎng)基的96深孔板中，于恒溫培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)5天。

2.2 對(duì)產(chǎn)漆酶微生物的定性測(cè)定

反應(yīng)體系為1.76mmol/L愈創(chuàng)木酚20μL，酶液50μL。加入50μL酶液，再加入20μL愈創(chuàng)木酚，45℃水浴反應(yīng)50min，之后恒溫箱中100℃靜置15min，觀(guān)察并記錄產(chǎn)酶菌生長(zhǎng)狀況。

2.3 對(duì)產(chǎn)漆酶微生物的定量測(cè)定

將篩出的產(chǎn)漆酶菌株從對(duì)應(yīng)EP管中接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的96深孔板中，30℃恒溫培養(yǎng)3天。漆酶活力測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚的方法，具體方法如下：

配制愈創(chuàng)木酚1.76mmol/L（置于搖床30℃、150rpm，待愈創(chuàng)木酚溶解）、乙酸-乙酸鈉緩沖液10m mol/L。對(duì)照組接菌液后沸水浴5min以滅活后，加入已配好的乙酸-乙酸鈉緩沖液和愈創(chuàng)木酚溶液，與實(shí)驗(yàn)組共同水浴反應(yīng)，反應(yīng)后沸水浴5min顯色并終止反應(yīng)。

2.4 5菌落形態(tài)觀(guān)察

待所篩選的高產(chǎn)菌株與一株白腐菌分別對(duì)應(yīng)劃線(xiàn)接種于LB，改良高氏一號(hào)和PDA固體培養(yǎng)基平板上，在30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀(guān)察菌落形態(tài)及菌絲狀態(tài)。

3 結(jié)果

3.1 產(chǎn)漆酶菌株篩選及分離結(jié)果

將從土壤中篩出的244個(gè)菌株裝于4個(gè)96深孔板中，于恒溫培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)5天。選取了其中2個(gè)菌株進(jìn)行了菌落形態(tài)分析。PDA-6.0-24：為黑曲霉菌株，菌落密集，菌絲較短；高-10.0-10：為真菌菌株，菌落光滑密集，呈黃色圓形。

3.2 菌株酶活測(cè)定結(jié)果

3.2.1 產(chǎn)酶微生物的定性分析

將4盒96深孔板中菌株對(duì)應(yīng)接入96孔板中，利用愈創(chuàng)木酚的方法測(cè)定其活性。反應(yīng)體系為1.76mmol/L愈創(chuàng)木酚20μL，酶液50μL，先加酶液，后加愈創(chuàng)木酚，45℃水浴反應(yīng)50min。利用肉眼辨別96孔板中反應(yīng)體系顏色變化，變化明顯的菌株為產(chǎn)酶活性高的菌株并作記錄。

在無(wú)菌操作臺(tái)中，無(wú)菌操作程序，利用滅菌后的牙簽將所篩選的7株高產(chǎn)菌株從EP管中接入裝有相應(yīng)pH的液體發(fā)酵培養(yǎng)基的試管中培養(yǎng)，恒溫培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)3天，待后續(xù)的酶活測(cè)定分析。

3.2.2 產(chǎn)酶微生物的定量分析

配制愈創(chuàng)木酚1.76mmol/L（置于搖床30℃、150rpm，待愈創(chuàng)木酚溶解）、乙酸-乙酸鈉緩沖液10m mol/L。

對(duì)照組接菌液后沸水浴5min以滅活后，加入已配好的乙酸-乙酸鈉緩沖液和愈創(chuàng)木酚溶液，與實(shí)驗(yàn)組共同水浴反應(yīng)，反應(yīng)后一同沸水浴5min顯色并終止反應(yīng)。

液體發(fā)酵實(shí)驗(yàn)顯示，在相同條件下，酶活力在不同菌株間有較大差異，其中白腐菌（白）所產(chǎn)漆酶的活力最高，黑曲霉（A4）次之，其余菌株相對(duì)較低，由于白腐菌有很高的漆酶分泌能力，故將其作為進(jìn)一步研究的實(shí)驗(yàn)菌。

4 結(jié)語(yǔ)

麩皮作碳源、酵母膏作氮源有利于白腐菌漆酶的分泌，pH5.0～5.4的范圍內(nèi)對(duì)漆酶的分泌影響差別不大。結(jié)果表明：麩皮20g/L、酵母膏5g/L、pH5.0、接種量5%、裝液量50mL、溫度30℃、搖床轉(zhuǎn)速120rpm是白腐菌產(chǎn)漆酶的最優(yōu)化條件，第8天達(dá)產(chǎn)酶最高峰，峰值酶活為365U/mL為進(jìn)一步對(duì)白腐菌的深入研究奠定了一定理論基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1]Huttermann，A.，Mai，C.&Kharazipour，A. Modification of lignin for the production of new compounded materials[J]，Appl Microbiol Biotechnol，2001，55（4）：387-394.

[2]Susana RC，Jose LTH Tndustrial and biotechnological applications of laccases：A review [J].Biotechnology Advances，2006，24：500一513.

[3]黃乾明，謝君.漆酶高產(chǎn)菌株的誘變選育及其產(chǎn)酶條件[J].菌物學(xué)報(bào)，2006，25（2）：263一272.