劉琴

摘要：克隆動物的研究在異種器官移植、抗病育種和乳腺生物反應(yīng)器等方面具有廣泛的應(yīng)用前景， 但目前的克隆動物的效率很低，只有不到10%的胚胎能發(fā)育到個體，而且這些個體中多有異常發(fā)育的現(xiàn)象。本文主要對導致克隆動物異常發(fā)育的原因在細胞水平作了較為全面的分析。

關(guān)鍵詞：克隆 核移植 異常發(fā)育

中圖分類號：Q132 文獻標識碼：A 文章編號：1672-5336（2013）14-0036-03

1997年2月27日，英國《自然》雜志公布了一項愛丁堡羅斯林研究所威爾莫特等人的研究成果：經(jīng)歷了247次失敗之后，終于在1996年他們得到了一只克隆雌性小綿羊，取名“多利”。自從多利產(chǎn)生國內(nèi)外生物科學工作者在克隆動物技術(shù)上取得了顯著的成績。在畜牧業(yè)中，克隆動物具有提高動物生產(chǎn)性能、繁育優(yōu)良品種、改善畜產(chǎn)品質(zhì)量等優(yōu)勢；在醫(yī)藥方面，克隆動物在研究人類疾病模型、異種器官移植和生產(chǎn)生物醫(yī)藥產(chǎn)品方面都顯示出了巨大的研究潛力。但是目前生產(chǎn)的克隆動物普遍出現(xiàn)死亡率高，個體發(fā)育不正常的現(xiàn)象。通過研究發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象與許多細胞因素有關(guān)，包括：核供體的重編程、卵母細胞的成熟發(fā)育、X染色體活性和基因表達、線粒體的變化、細胞因子的效應(yīng)等。

1 核供體重編程和卵母細胞成熟

核移植一大目的就是獲得多產(chǎn)的后代，但是要成功的獲得后代還需要許多事件能夠正常發(fā)生。首先就是核供體需處在一種能夠被重塑，基因組能夠被逐漸的重編程的狀態(tài)；其次就是受體卵母細胞必須成熟，能夠啟動重組胚的發(fā)育；再者，就是體外培養(yǎng)體系必須適應(yīng)這種胚胎的生長需求。代孕動物的生理狀態(tài)對核移植后代的成功繁育也有著十分重要的影響，例如，處于排卵前或是排卵后的狀態(tài)，不同的季節(jié)等對應(yīng)的胚胎的妊娠率和分娩率都有所不同。

核移植過程中，目前不僅囊胚發(fā)育率和妊娠率較低，而且產(chǎn)生的后代個體也多有異常問題而出現(xiàn)新生胎兒出生不久就死亡的現(xiàn)象。主要表現(xiàn)在胎兒個頭大，心臟肥大、卵圓孔閉合不全、瓣膜發(fā)育不全，肝臟腫大和充血、肝組織發(fā)育不全、脂肪沉積嚴重，肺不能正常充氣、形態(tài)畸形，脾臟較小、出血，腎臟不成形、伴有大量脂肪沉積，腦組織發(fā)育不全、含量少，等。1-7究其原因，除了上面提到的，估計得追溯到表觀修飾異常和發(fā)育相關(guān)基因表達異常等細胞內(nèi)深入的活動機制上來。8-10

2 X染色體

由于劑量補償效應(yīng)，哺乳動物的雌性胚胎中的一條X染色體會發(fā)生失活。Xist基因的表達決定了這一效應(yīng)的發(fā)生，而且Xist在二細胞時期就開始表達。其表達還引起了子代細胞中X染色體復制不同步，特別是在胚胎致密化之后，這種不同步X復制的細胞比例逐漸增加。

體外生產(chǎn)的胚胎在培養(yǎng)過程中，雄性胚的生長狀況要優(yōu)于雌性胚，特別是在培養(yǎng)液中含有高濃度的葡萄糖、血清以及相對較高的溫度都會給雌性胚的生長帶來不利影響。這種發(fā)育的二態(tài)現(xiàn)象，很可能是由于培養(yǎng)環(huán)境引起了基因的差異表達。但讓人迷惑的是，有一研究發(fā)現(xiàn)，有384個基因在正常胚與體外形成胚里表達有差異，其中85%基因在IVP胚胎中表達下調(diào)；而與X染色體相關(guān)的基因表達卻上調(diào)11，而且這一情況在雄性胚和雌性胚中相同。Xist與二態(tài)現(xiàn)象之間究竟有什么樣的關(guān)系人需要進一步探索。

在研究X相關(guān)基因在存活和死亡克隆牛中的表達時，發(fā)現(xiàn)很多基因出現(xiàn)異常表達。有意思的是，Xist基因在雄性克隆牛的組織中呈高度甲基化，而在雌性克隆牛組織內(nèi)Xist普遍處于低甲基化水平，而且出生后死亡的克隆牛比圍產(chǎn)期死亡的還要低。這與核重編程不完全有很大的關(guān)系，而且與X染色體選擇性隨機失活受到干擾有關(guān)。盡管Xist基因的甲基化和Xist的轉(zhuǎn)錄都有是組織差異的，但是Xist基因DNA甲基化程度高的樣品的Xist轉(zhuǎn)錄水平也高，這似乎暗示著還存在其他因素在調(diào)控Xist轉(zhuǎn)錄上起著更大的作用。總之，X染色體的劑量效應(yīng)及其印記修飾狀況與胚胎的正常發(fā)育有著重要的作用。

3 線粒體

線粒體在機體里發(fā)揮重要作用，它不僅給細胞直接提供能量，而且能維持細胞穩(wěn)態(tài)，介導了信號轉(zhuǎn)導和凋亡等生理活動。線粒體在細胞內(nèi)的數(shù)量，形態(tài)和分布狀態(tài)都影響著細胞的生理功能。線粒體內(nèi)部基因功能不全，其分離、融合等過程都受到核基因的協(xié)作。在成熟的卵母細胞中線粒體的拷貝數(shù)約為105個，當其受精后，胚胎發(fā)育到囊胚的這段時期，線粒體都不重新合成，都是使用卵母細胞遺傳而來的線粒體。近來，研究發(fā)現(xiàn)含有高拷貝線粒體的卵母細胞其受精率更高，而且對胚胎發(fā)育更有利。Wai等發(fā)現(xiàn)含有4000個拷貝的線粒體能夠發(fā)育到胚胎附植前，而要能夠完成完成附植后發(fā)育線粒體的數(shù)量至少要40000-50000個12。對附植前的胚胎進行研究，發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)條件能引起胚胎內(nèi)線粒體過早的開始復制，線粒體的形態(tài)與定位模式也有所改變。但是目前線粒體影響細胞功能的詳細機理還不太清楚。

4 細胞因子

目前，由體細胞核移植或體外受精生產(chǎn)的胚胎成功發(fā)育為個體的成率要低于10%。高達70%的核移植胚胎在妊娠的前三個月就會發(fā)生流產(chǎn)。而胎盤發(fā)育異常是這一現(xiàn)象的主要原因，表現(xiàn)為胎盤子葉重量增加，胎盤子葉數(shù)量減少。即使部分胚胎幸運地發(fā)育到個體，不少個體也會出現(xiàn)巨大綜合癥。這些克隆帶來的非正?，F(xiàn)象，主要與基因不能按照正常的模式表達有關(guān)。其中，與細胞分裂增殖和個體生長發(fā)育密切相關(guān)的類胰島素生長因子，及其對應(yīng)的受體和結(jié)合蛋白的正常表達對維持胚胎的正常發(fā)育有重要的意義。

IGFs有兩種類型，IGF-I和IGF-II。IGF-I既有促進生物合成代謝的功能，又有促生長的功能。IGF-II可以介導酶和生物大分子的降解。結(jié)合蛋白除了能運輸IGFs幫助其定位外，還能延長其半衰期以及調(diào)節(jié)其活性。它們在胚胎發(fā)育期的一個重要的作用就是可以調(diào)節(jié)出生個體的大小。

研究發(fā)現(xiàn)：在25日齡牛胚中，體外受精產(chǎn)生的胚胎表達的IGF-I的水平要顯著高于正常發(fā)育的胚胎組織；核移植形成的胚胎表達的IGF-II的水平又要顯著高于體外受精形成的胚胎；核移植產(chǎn)生的胚盤組織中表達的IGF-II的水平也要顯著高于正常的胚盤13。研究還發(fā)現(xiàn)：看似正常的克隆牛在出生時血漿中IGF-II的濃度明顯高于人工受精的正常對照牛，而出生15天后的IGF-II濃度明顯降低； IGF-I在妊娠150天胎兒血漿中的濃度明顯高于IVP的正常對照；核移植胎盤尿囊液中IGFBP-l的水平也明顯升高14。

5 結(jié)語

當前動物克隆技術(shù)作為一項新技術(shù)，由于其巨大的科研價值和應(yīng)用價值而發(fā)展迅速，但是克隆動物成活率低成為此項技術(shù)的制約瓶頸，在克隆動物技術(shù)中還存在許多科學問題仍尚待解決。克隆動物的異常發(fā)育原因可能與細胞內(nèi)活動的許多因素都相關(guān)，除了上訴提到的因素以外，還有組蛋白的修飾、其他類型的細胞因子、體外培養(yǎng)條件等方面的因素。時下較為流行的重編程理論和表觀遺傳學理論還不能在微觀層面深入對異常發(fā)育現(xiàn)象作出合理的解釋，新的研究方法和技術(shù)以及新發(fā)現(xiàn)急需出現(xiàn)。

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