張婉 李麗

摘 要：簡述了SSR分子標記的基本原理和特點，從白菜種質資源遺傳多樣性分析、SRR指紋圖譜的構建、雜交種純度的鑒定、遺傳圖譜構建和分子標記在輔助育種上的應用等幾個方面介紹了近年來白菜研究中SSR分子標記的研究進展及應用前景。

關鍵詞：白菜；分子標記；SSR；遺傳分析

引言

白菜（Brassica campestris L. ssp. Pekinensis）原產于我國北方，現(xiàn)廣泛種植于全國的標志性蔬菜種類之一，分為結球白菜、不結球白菜兩個亞種。由于不同的白菜品種之間可以進行天然的雜交，如隔離不當以至于品種之間混淆，形成了很多栽培亞種或變種，且現(xiàn)今大量的白菜新品種涌入市場，因此，品種差異的鑒定在蔬菜生產和使用中顯得尤為重要。對于商用種子的品種鑒別，新品種登記測試以及資源種質遺傳多樣性分析，都非常需要發(fā)展一種高效、快速、準確和經濟實用的品種鑒別方式[1]。近年來生化和分子標記技術的快速發(fā)展使得其在鑒別能力、速度及準確性方面都比傳統(tǒng)的種植鑒別有明顯的優(yōu)勢，并且這些技術已經應用于茄子、黃瓜、玉米、水稻等蔬菜作物種質資源的鑒定，指紋圖譜的構建，分子標記輔助選擇育種及雜交種純度的檢測。利用分子技術已經在白菜的研究中進行了遺傳多樣性的分析，SSR指紋圖譜的構建，品種真實性的鑒定及純度的檢測等大量工作[2-4]。在新品種審定及新品種的品種權授予前需要進行DUS測試，確定該品種的特異性（Distinctness）、一致性（Uniformity）和穩(wěn)定性（Stability） ，由于在各項研究中運用了分子標記技術，大大減少了實際中對于白菜種子檢測的工作量。

現(xiàn)階段在蔬菜研究中應用較廣泛的DNA分子標記主要包括擴增片段長度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）、隨機擴增的多態(tài)性 （random amplified polymorphic DNA，RAPD）、相關序列擴增多態(tài)性（sequence-related amplified polymorphism，SRAP）、簡單重復序列區(qū)間擴增多態(tài)性（ simple sequence repeats，SSR）。AFLP標記技術是基于PCR擴增基因組DNA限制性片段，目前在甘藍、大白菜、番茄、馬鈴薯、黃瓜等蔬菜作物的品種純度鑒定上得以應用，但由于其操作程序較復雜，成本較高，影響其在商業(yè)品種鑒定中的廣泛使用。RAPD技術自建立以來就在蔬菜研究中得到廣泛的應用[5]，然而對于栽培品種之間真實性鑒別，其多態(tài)性頻率相對較低，實驗重復性較差，影響其在品種鑒定中廣泛應用。SRAP是一種新型的基于PCR的標記系統(tǒng)，最早是在蕓薹屬作物開發(fā)出來。SSR分子標記技術通過設計引物進行SSR的多態(tài)性分析的方法已在植物中得到較廣泛的應用。本文對于應用較廣泛的SSR分子標記技術在白菜品種鑒定中的研究及應用現(xiàn)狀進行了概述，為今后的白菜研究工作提供一定的參考。

1 SSR分子標記的基本原理和特點

SSR也叫微衛(wèi)星DNA，一般由幾個核苷酸（2-5bp）序列簡單串聯(lián)成重復序列，根據微衛(wèi)星序列兩端的保守序列設計特異性引物，通過PCR反應擴增，并將擴增產物進行凝膠電泳檢測得到的擴增片段，從而來揭示其多態(tài)性。SSR具有以下幾個特點：（1）一般檢測到的是一個單一的多等位基因位點；（2）呈共顯性遺傳，可用來對雜交種進行純度檢測；（3）實驗所需DNA量較少，且操作簡單，實驗重復性好，結果可靠性高；（4）數量豐富，且均勻覆蓋整個染色體組。與其他分子標記技術相比，SSR標記在遺傳多樣性分析和品種鑒定上的優(yōu)勢顯而易見，重要的是可以選特定的染色體上特定位置的SSR標記進行種質資源的鑒定和雜交種純度的檢測。

2 白菜種質資源遺傳多樣性的分析

分子標記在種質資源遺傳多樣性的研究中是一種有效的技術手段，目前，主要應用在遺傳多樣性分析中的分子標記技術有AFLP、ISSR和SSR標記等[6-7]，其中SSR標記以其豐富的多態(tài)性被廣泛應用于蔬菜作物品種的遺傳多樣性的分析中。楊華[8]等利用SSR分子標記技術，對17份甘藍、44份白菜，共61份蕓薹屬蔬菜進行遺傳多樣性分析，結果顯示，所有材料被分為甘藍和白菜兩大類，其中白菜類品種的遺傳相似系數在0.96～0.77之間，甘藍類品種相似系數在0.93～0.63之間。并且作者還通過SSR分子標記技術與農藝性狀鑒定相結合的方法來進行蕓薹屬蔬菜的多樣性的分析，彌補了單一農藝性狀鑒定上的不足之處，使之更加準確可靠。另外，在ISSR標記分析遺傳多樣性方面，杜黎明[9]等利用ISSR分子標記法，用11個具有高多態(tài)性引物對65個白菜樣品進行PCR擴增，共擴增出107條譜帶，其中多態(tài)性位點102個。對結果進行遺傳多樣性的分析，遺傳相似系數在0.40-0.65之間。聚類分析結果表明，能將65個白菜品種劃分為4大類，并表現(xiàn)出大部分種質資源關系與其來源地有一定的相關性。張波[10]對不結球白菜晚抽薹分子標記及抽萎性的遺傳多樣性進行了分析研究，研究表明，利用的RAPD、SSR，ISSR、SRAP多種分子標記手段進行遺傳分析，最后僅從SSR引物中得到一條引物DBCl6與晚抽薹基因緊密連鎖，其遺傳距離為5.7cM，其余分子標記方式則均未發(fā)現(xiàn)與晚抽薹基因緊密連鎖的分子標記。王笑一[11]等在用20對SSR引物建立80個小白菜品種的指紋圖譜的前提下，并對其進行了遺傳特異性分析，聚類分析表明，87.50% 的品種具有遺傳特異性。

3 SSR指紋圖譜的構建和雜交種純度的鑒定

現(xiàn)階段我國對于白菜種質資源主要通過農藝性狀和形態(tài)表型進行鑒定的，由于鑒定周期較長，性狀差異不明顯，且受環(huán)境影響較大，從而難以將不同種質資源完全區(qū)分開來。品種間無論從形態(tài)、生理和生化上的區(qū)別，其實都是DNA水平上的差異，所以運用分子標記技術是通過直接分析遺傳多態(tài)性從DNA水平上來鑒定品種間差異。SSR由于具有高多態(tài)性和可重復性，是應用于蔬菜作物類品種間鑒定及雜交種純度的鑒定較廣泛的分子標記技術之一，李麗[1]等開發(fā)了由3個引物對組成的6套EST-SSR復合標記組合，并完成了43個白菜品種的鑒別和大白菜品種差異的檢測，驗證了其EST-SSR復合標記能代表白菜品種間的多態(tài)性、品種內一致性、穩(wěn)定性和重復性，并且可以高效準確的對白菜和大白菜品種的真實性和雜交純度進行鑒別。

白菜雜交種是由獨立的兩個自交系雜交組配形成的，這兩個自交系均可獨立地與其他許多自交系組配，對于有些優(yōu)良的自交系，其使用頻率極高，所以造成大量品種都是同父異母或同母異父，其品種間的特異性鑒定更加困難。相比傳統(tǒng)的品種鑒定技術，SSR分子指紋技術是對新品種審定和檢測品種唯一性、一致性及穩(wěn)定性的一種較有效的分子技術方法。雖然不能僅用其作為直接判定品種具有特異性的依據，但可以通過分子技術形成的品種SSR指紋圖譜數據信息篩查出與之近似的品種，然后將新申請的品種與近似品種田間并排種植，進行形態(tài)DUS測試，從而達到對新品種鑒定的目的。目前黃瓜、柑橘、玉米、小麥等作物已經構建了SSR指紋圖譜運用在品種鑒定方面。雖然目前白菜在構建SSR指紋圖譜數據這方面鮮有報道，王笑一[11]等已經從131對SSR引物中篩選了2O對多態(tài)引物組合，對80個品種進行了分析，利用其中5對引物Nal2E02、Nal2A08、Ni4D09、BRMS-269和BRMS-296的組合，可以將80個品種完全分開，從而構建了SSR指紋圖譜。

4 遺傳圖譜構建和分子標記在輔助育種上的應用

隨著現(xiàn)代分子生物技術的快速發(fā)展，從以往的利用雜種優(yōu)勢進行白菜品種的選育到現(xiàn)在的以分子標記作為白菜品種的一種有效的輔助育種手段[12]。其中SSR標記多態(tài)性高、共顯性遺傳、穩(wěn)定和可重復性好，適合于對蔬菜作物進行遺傳圖譜的構建、QTL定位和作為輔助育種的手段，單曉政[13]等運用ISSR、RAPD、SSR、sRAP等分子標記來構建不結球白菜分子遺傳連鎖圖譜，分析結果表明構建的連鎖圖譜包含l1個連鎖群，由139個標記組成，包括19個RAPD標記、22個SSR標記、4個ISSR標記和94個SRAP標記。另外，原玉香[14]等利用SRAP、SSR、AFLP、STS、ESTP和CAPS等多種分子標記和形態(tài)標記，以大白菜晚抽薹DH系Y177-12和早抽薹DH系Y195-93為親本建立的183個DH系為作圖群體構建了大白菜遺傳圖譜，為不同圖譜的比較與整合及重要農藝性狀的基因定位奠定基礎。張明科[15]等利用231個多態(tài)性標記，以紫菜薹和結球白菜雜交的F2群體為材料，建立了包含163個標記、11個連鎖群和4個片段的大白菜分子連鎖圖譜，其中包括117個RSAP標記、38個SRAP標記、5個SSR標記和3個RAPD標記。通過對圖譜的分析，該圖譜可有效的用于紫色等性狀的QTL定位分析。Yuefei Li[16]等，利用71個SSR標記、145個SRAP標記建立了黃芯白菜的分子鏈鎖圖譜，平均遺傳距離為3.8cm，分析結果顯示，有3個QTLs控制了白菜黃芯的性狀表現(xiàn)，40%發(fā)生了表型變異。

其中抗病育種是白菜育種者長期關注的問題之一，分子標記技術在大白菜抗病育種中也進行了一定量的研究。彭海濤[17]等利用群體分離分析法（BSA法）和SSR標記進行與不結球白菜抗蕪菁花葉病毒（TuMV）基因連鎖標記的篩選。通過SSR引物篩選，得到54對在雙親間穩(wěn)定表現(xiàn)多態(tài)性的引物。其中1個與蕪菁花葉病毒抗病基因連鎖的SSR標記Ra3E05，連鎖距離為8.7cm，根據測序結果重新設計引物，用F：群體對其驗證，帶型與原SSR標記表現(xiàn)一致，可用于分子標記輔助育種。

5 問題與展望

綜上所述，目前在遺傳多樣性的分析、品種真實性和純度的鑒定以及在育種方面的研究中，SSR分子標記與其他分子標記類型相比，以其獨特的優(yōu)勢在白菜的分子水平上的研究有著極大的應用價值及潛力。但與棉花、水稻、玉米等作物在分子標記方面的研究相比，都存在較大的差距，同時也具有較大的研究空間。在白菜需要審定和登記的新品種日益增多的情況下，對于其品種真實性及純度的鑒定上，SSR分子指紋技術具有重要的應用前景?，F(xiàn)階段在這方面還鮮有報道，所以構建白菜的指紋圖譜數據庫對于品種鑒定是一種重要的分子技術手段，并與原有的形態(tài)DUS測試系統(tǒng)是相融合的。在白菜分子標記輔助育種方面，對白菜進行遺傳多樣性的分析和遺傳圖譜的構建可以使育種者清楚的了解到種質資源的遺傳背景，再根據其育種要求進行改造和創(chuàng)新，培育出品質優(yōu)良、抗逆性顯著及抗病蟲害較強的新品種，是我國育種者當前比較重要的工作。

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作者簡介：張婉（1986.4-），女，在讀碩士，研究方向：植物分子生物學。

李麗（1963.6-），女，碩士，職稱：高級農藝師，研究方向：利用分子標記進行雜交種純度及品種真實性鑒定。

通訊作者：李麗

*通訊作者：lili@nercv.org