張廷婷等

摘要：通過(guò)規(guī)模測(cè)序和生物信息學(xué)分析，從花生莢果不同發(fā)育時(shí)期全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)中篩選出MADS-box家族的一個(gè)cDNA全長(zhǎng)序列，命名為CEM1基因（GenBank登錄號(hào)為EY396043）。該基因全長(zhǎng)1 061 bp，包含762 bp的開(kāi)放閱讀框，編碼253個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)的分子量為29405 ku，等電點(diǎn)（pI）為918。蛋白質(zhì)信號(hào)肽分析和疏水性分析表明，該基因編碼的蛋白質(zhì)信號(hào)肽剪切的可能性很小，具有親水性。同時(shí)構(gòu)建CEM1基因的VIGS表達(dá)載體，為進(jìn)一步研究該基因的功能奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：花生；莢果發(fā)育；CEM1基因；生物信息學(xué)；載體構(gòu)建

中圖分類號(hào)：Q785：S565.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2013）08-0009-06

MADS-box的名稱來(lái)自釀酒酵母轉(zhuǎn)錄因子MCM1、擬南芥花同源異型基因蛋白AGAMOUS、金魚(yú)草花同源異型基因蛋白DEFICIENS和人血清應(yīng)答因子SRF 4種蛋白的首字母，這4種蛋白質(zhì)都有一個(gè)由56～58個(gè)氨基酸組成的高度保守的MADS盒，編碼含有這種保守序列蛋白因子的基因稱為MADS-box基因。病毒誘導(dǎo)的基因沉默（Virus-induced gene silencing， VIGS）是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象，可以引起內(nèi)源mRNA序列特異性降解_[1，2]，即如果在病毒載體中加入目的基因片段，侵染寄主植物后，植物會(huì)表現(xiàn)出目的基因功能喪失或者表達(dá)水平下降的表型，從而確定基因功能。其作用機(jī)制為：含有目的基因片段的病毒載體在被侵染的植物組織中大量復(fù)制，病毒載體中的目的片段在RNA引導(dǎo)的RNA聚合酶作用下合成大量的雙鏈RNA（Double-stranded RNA， dsRNA）；dsRNA在Dicer酶的作用下產(chǎn)生21～25個(gè)核苷酸的短干擾RNA（Small interfering RNA， siRNA）；然后，siRNA的反義鏈和RNA誘導(dǎo)的基因沉默復(fù)合物（RNA-induced silencing complex， RISC）結(jié)合，特異性識(shí)別細(xì)胞質(zhì)中目的基因的單鏈mRNA，造成目的基因mRNA的特異性降解，從而導(dǎo)致目的基因在RNA水平上的沉默_[3～5]。本試驗(yàn)克隆了花生MADS-box基因，對(duì)其及編碼的蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并構(gòu)建了VIGS表達(dá)載體，為轉(zhuǎn)基因奠定基礎(chǔ)，這對(duì)花生分子育種實(shí)踐以及闡明果實(shí)與種子發(fā)育相關(guān)的遺傳和生理現(xiàn)象具有重要意義。

1材料與方法11試驗(yàn)材料

1.1.1植物材料本研究所用材料為花生品種閩花6號(hào)。

1.1.2試劑與儀器本研究所用逆轉(zhuǎn)錄酶、DNA酶、Ex Taq酶 、RNA酶抑制劑、內(nèi)切酶NcoⅠ和PstⅠ、dNTPs等購(gòu)自大連寶生物公司；DNA膠回收試劑盒購(gòu)自北京博大泰克公司；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自北京博大泰克公司；引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；其它化學(xué)試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

Biometra PCR儀購(gòu)自華粵行儀器有限公司；UV-2800/2802/2802S型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)購(gòu)自尤尼柯（上海）儀器有限公司；UV-2000系列紫外分析儀購(gòu)自天能科技（上海）有限公司。

2結(jié)果與分析

2.1花生CEM1基因的克隆

通過(guò)全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)篩選和EST測(cè)序得到了該基因的EST序列，其克隆號(hào)為2P7，命名為CEM1， GenBank登錄號(hào)為EY396043。雙向測(cè)序結(jié)果表明CEM1全長(zhǎng)1 061 bp，包含一個(gè)762 bp的ORF，編碼253個(gè)氨基酸（圖1），相對(duì)分子量為29405 ku，理論等電點(diǎn)（pI）為918。將該基因序列在NCBI中進(jìn)行Blast比較，結(jié)果與豌豆已知基因（GenBank 登陸號(hào)為AAX69070）的同源性為79%；將推導(dǎo)的氨基酸序列在蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)里進(jìn)行Blast分析，結(jié)果與一個(gè)花生MADS-box基因氨基酸序列同源性為84%，由此確認(rèn)CEM1是花生MADS-box基因。

2.2CEM1蛋白序列分析

將推導(dǎo)的CEM1氨基酸序列與其它10個(gè)物種來(lái)源的MADS-box氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。序列比對(duì)結(jié)果顯示CEM1與大豆的AGL1（GI：358248235）序列比較一致，與苜蓿等其它來(lái)源的氨基酸序列也存在一定的同源性（圖2）。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果顯示CEM1與大豆AGL1親緣關(guān)系較近（圖3）。

2.3CEM1蛋白的結(jié)構(gòu)域、信號(hào)肽與疏水性分析

將推導(dǎo)的CEM1氨基酸序列進(jìn)行保守區(qū)域分析，發(fā)現(xiàn)該序列有兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域：MADS_MEF2_like功能域和K-box結(jié)構(gòu)域（圖4）。具有MADS-box蛋白的典型結(jié)構(gòu)。

3討論

MADS-box是一類數(shù)量龐大的基因家族，其編碼的蛋白是一類轉(zhuǎn)錄因子，具有高度保守的MADS-box 結(jié)構(gòu)域和半保守的能形成卷曲螺旋的K區(qū)_[6]。MADS-box基因又分為3個(gè)主要類群，即ARG80基因家族、MEF2基因家族以及MIKC基因家族_[7]。植物基因組含有大量的MADS-box基因，它在植物的發(fā)育過(guò)程尤其是生殖發(fā)育過(guò)程中起著廣泛的調(diào)節(jié)作用_[8]，其主要功能是調(diào)控植物花的發(fā)育和果實(shí)的成熟。但也有研究顯示MADS-box調(diào)控著其它器官的發(fā)育，如Buchner等發(fā)現(xiàn)一個(gè)MADS-box基因在豌豆種皮中表達(dá)_[9]。關(guān)于花生MADS-box基因及其對(duì)胚胎和種子發(fā)育過(guò)程調(diào)節(jié)作用的研究還未見(jiàn)報(bào)道。本研究克隆得到花生CEM1基因，經(jīng)生物信息學(xué)分析，確認(rèn)為花生MADS-box家族的一員，并構(gòu)建了VIGS表達(dá)載體，對(duì)于利用遺傳操作技術(shù)如轉(zhuǎn)基因等培育優(yōu)良的作物品種_{[10，11，12]}、解釋植物生長(zhǎng)發(fā)育理論和闡明相關(guān)的遺傳和生理現(xiàn)象等具有重要意義。

參考文獻(xiàn)：

[1]王宏芝， 李瑞芬， 王國(guó)英， 等 病毒誘導(dǎo)的基因沉默及其在植物功能基因組學(xué)研究中的應(yīng)用[J] 自然科學(xué)進(jìn)展， 2005， 15（1）： 8-14

[2]Bartel D P MicroRNAs： genomics， biogenesis， mechanism， and function [J] Cell， 2004， 116（2）： 281-297

[3]Burch-Smith T M， Anderson J C， Martin G B， et al Applications and advantages of virus-induced gene silencing for gene function studies in plants [J] The Plant Journal， 2004， 39（5）： 734-746

[4]Kjemtrup S， Sampson K S， Peele C G， et al Gene silencing from plant DNA carried by a Geminivirus[J] The Plant Journal， 1998，14（1）：91-100

[5]Martinez J， Patkaniowska A， Urlaub H， et al Single-stranded antisense siRNAs guide target RNA cleavage in RNAi[J] Cell， 2002， 110（5）： 563-574

[6]Ma H， Yanofsky M F， Meyerowitz E M AGL1-AGL6， an Arabidopsis gene family with similarity to floral homeotic and transcription factor genes [J] Genes Dev， 1991， 5（3）： 48-49

[7]Theissen G， Saedler H MADS-box genes in plant ontogeny and phylogeny： Haeckels ‘biogenetic law revisited [J] Curr OpinGenetDev，1995，5（5）：628-639

[8]Lucie P， Stefan F， Martin K， et al. Molecular and phylogenetic analyses of the complete MADS-Box transcription factor family in Arabidopsis New Openings to the MADS World [J] Plant Cell， 2003， 15（7）：538-1551

[9]Buchner P， Boutin J P A MADS box transcription factor of the AP1/AGL9 subfamily is also expressed in the seed coat of pea （Pisum sativum） during development [J] Plant Mol Biol， 1998， 38（6）：1253-1255

[10]張則婷， 李學(xué)寶 MADS-box基因在植物發(fā)育中的功能[J] 植物生理學(xué)通訊， 2007， 43（2）： 218-222

[11]李莉， 侯麗霞， 施木田， 等 番茄紅素環(huán)化酶基因片段克隆及反義表達(dá)載體構(gòu)建[J] 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2009，1：1-3

[12]馬樂(lè)園， 于喜艷 甜瓜果實(shí)八氫番茄紅素合成酶基因的克隆及正義表達(dá)載體的構(gòu)建[J] 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2011，8：4-7