范光明

[摘要] 目的 探討哮喘患兒單個核細(xì)胞FOXP3 mRNA表達(dá)應(yīng)用實時熒光定量RT-PCR檢測的臨床意義。 方法 選取來本院就診的29例哮喘患兒和24例正常健康兒童作為對照，對兩組病例應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測外周血單個核細(xì)胞（PBMCs）中CD4+CD25+Treg的比例，并鑒定PCR產(chǎn)物特異性。 結(jié)果 哮喘患兒組CD4+CD25+Treg檢測結(jié)果為（8.26±2.04）%，顯著低于對照組（12.71±2.53）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。哮喘患兒組FOXP3/β-actin的2-△Ct值為（0.49±0.15），對照組為（0.62±0.18），兩者比較，有顯著性差異（P<0.05）。外周血單個核細(xì)胞中FOXP3 mRNA表達(dá)與淋巴細(xì)胞中CD4+CD25+Treg比例呈正相關(guān)（r=0.679，P<0.05）。經(jīng)融解曲線分析顯示FOXP3和β-actin均僅有單一擴(kuò)增產(chǎn)物。 結(jié)論 對于哮喘患兒單個核細(xì)胞FOXP3 mRNA表達(dá)水平應(yīng)用實時熒光定量RT-PCR檢測，方法簡便，結(jié)果穩(wěn)定、可靠。

[關(guān)鍵詞] 哮喘；單個核細(xì)胞；FOXP3 mRNA；CD4+CD25+Treg；實時熒光定量RT-PCR

[中圖分類號] R446.43 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] B [文章編號] 2095-0616（2013）08-125-02

CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）是一群具有免疫抑制功能的T細(xì)胞，在CD4+CD25+Treg上可見FOXP3特異性高水平表達(dá)，它具有反映CD4+CD25+Treg的活性水平[1-3]。研究表明，CD4+CD25+Treg與哮喘的發(fā)生和發(fā)展有著密切關(guān)系，CD4+CD25+Treg能夠?qū)h2細(xì)胞的活化起到抑制作用[4]。本研究探討了哮喘患兒單個核細(xì)胞FOXP3 mRNA表達(dá)應(yīng)用實時熒光定量RT-PCR檢測的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取于本院就診的29例經(jīng)哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]確診的哮喘患兒，其中男19例，女10例；年齡3～14歲，平均（6±2）歲；哮喘病程2～8年。并選取24例正常無過敏性疾病史的健康兒童作為對照組，其中男15例，女9例；年齡3～13歲，平均（6.0±1.5）歲。兩組性別、年齡等一般資料經(jīng)比較無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 方法

采集靜脈血4 mL，分別裝入兩支EDTA抗凝試管中，各2 mL。應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測外周血單個核細(xì)胞（PBMCs）中CD4+CD25+Treg的比例，采用融解曲線和瓊脂糖電泳鑒定PCR產(chǎn)物特異性，包括引物設(shè)計、淋巴細(xì)胞分離、逆轉(zhuǎn)錄、熒光定量PCR反應(yīng)體系、擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS15.0統(tǒng)計學(xué)軟件，計量資料采用（）表示，采用t檢驗，計數(shù)資料采用x2檢驗，P<0.05為差異有顯著性意義。

2 結(jié)果

2.1 熒光定量方法學(xué)評價

2.1.1 特異性 FOXP3和β-actin擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳后出現(xiàn)約176bp和205bp兩條特異性條帶，經(jīng)融解曲線分析顯示FOXP3和β-actin均只有一個尖峰，分別是82.4℃解鏈溫度和87.8℃解鏈溫度，說明FOXP3和β-actin分別僅有一擴(kuò)增產(chǎn)物。

2.1.2 稀釋逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 10倍稀釋逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA，0.637/反應(yīng)為最低檢測限，0.637～0.796/反應(yīng)為線性范圍，相當(dāng)于Ct值18-37跨度，r=0.98。

2.1.3 精密度 重復(fù)測定Ct值為21和Ct值為35的2份標(biāo)本，結(jié)果經(jīng)對數(shù)處理后其批內(nèi)CV值為1.6%～2.8%，批間CV值為2.5%～6.7%。見圖1。

圖1 精密度測定

2.2 兩組CD4+CD25+Treg結(jié)果比較

哮喘患兒組CD4+CD25+Treg檢測結(jié)果為（8.26±2.04）%，對照組為（12.71±2.53）%，兩組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。

2.3 兩組FOXP3/β-actin的2-△Ct值比較

哮喘患兒組FOXP3/β-actin的2-△Ct值為0.49±0.15，對照組為0.62±0.18，兩者比較，有顯著性差異（P<0.05）。

2.4 FOXP3 mRNA與CD4+CD25+Treg的相關(guān)性

外周血單個核細(xì)胞中FOXP3 mRNA表達(dá)與淋巴細(xì)胞中CD4+CD25+Treg比例呈正相關(guān)（r=0.679，P<0.05）。

3 討論

與普通PCR比較，SYBR Green I實時定量PCR具有特異、快速、敏感特點。SYBR Green I實時定量PCR無需合成特異探針，故而使用方便，但非特異產(chǎn)物可干擾靶基因的產(chǎn)物定量。作為一種熒光染料，SYBR Green I能與雙鏈DNA非特異性結(jié)合并發(fā)出熒光，其與游離狀態(tài)熒光強(qiáng)度相比強(qiáng)百余倍，因此可以通過檢測熒光強(qiáng)度來檢測出雙鏈DNA數(shù)量。但檢測熒光強(qiáng)度也會出現(xiàn)假陽性結(jié)果，這是因為非特異性擴(kuò)增或引物二聚體也可以產(chǎn)生熒光，從而干擾檢測結(jié)果。鑒于假陽性結(jié)果的出現(xiàn)，本研究為了區(qū)別是由PCR產(chǎn)物產(chǎn)生的熒光信號還是本底造成的熒光信號，在定量反應(yīng)結(jié)束后特別進(jìn)行了融解曲線分析。由于在融解曲線上PCR產(chǎn)物是單一峰，Tm值也較非目的產(chǎn)物要高[9]，因此可以通過分析融解曲線來證實擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。本研究結(jié)果顯示，特異性FOXP3和β-actin擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)融解曲線分析顯示FOXP3和β-actin均只有一個尖峰，分別是82.4℃解鏈溫度和87.8℃解鏈溫度，說明其擴(kuò)增的特異性。

研究報道，兒童支氣管哮喘發(fā)病機(jī)制中免疫功能紊亂起著不容忽視的作用，目前關(guān)注的焦點在于淋巴細(xì)胞亞群的比例和功能紊亂。哮喘發(fā)病與免疫耐受的破壞和Th1/Th2功能失調(diào)有關(guān)。研究認(rèn)為，CD4+CD25+Treg水平和功能的正常維持對良好的免疫耐受狀態(tài)建立有很好的作用，從而對哮喘的發(fā)生和發(fā)展起到阻止作用[6]。FOXP3作為一種特殊的轉(zhuǎn)錄因子，在CD4+CD25+Treg上特異性高水平表達(dá)，它可以反映CD4+CD25+Treg的活性水平[7-8]。本研究結(jié)果顯示，在外周血CD4+CD25+Treg的比例及FOXP3 mRNA的表達(dá)上哮喘患兒組較對照組低，表明因CD4+CD25+Treg數(shù)量不足，以致免疫抑制功能降低，效應(yīng)性CD4+T細(xì)胞活化，特別是Th2細(xì)胞，大量致炎因子產(chǎn)生，從而使哮喘發(fā)作或持續(xù)。因此我們猜測，CD4+CD25+Treg與哮喘的發(fā)生和發(fā)展關(guān)系密切，對CD4+CD25+Treg的檢測將有助于哮喘患兒的診斷和治療。本研究結(jié)果還顯示，外周血CD4+CD25+Treg細(xì)胞數(shù)量和FOXP3 mRNA表達(dá)有相同的趨勢，存在一定的相關(guān)性。因此，這種從外周血單個核細(xì)胞中檢測FOXP3 mRNA的方法簡單，重復(fù)性好，敏感性和特異性較高，值得推廣。

[參考文獻(xiàn)]

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（收稿日期：2013-01-08）