陶吉寒　招雪晴等

摘要：從石榴（Punica granatum L.）泰山紅品種的花瓣中提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。設(shè)計簡并引物對石榴類黃酮3-羥化酶（F3H）基因進行PCR擴增，篩選合適的引物及退火溫度。結(jié)果表明，適合石榴F3H基因擴增的正反向引物分別為5′-CGTNGAYGTBGTBGTBGCSKCVTC-3′，5′-TCHCCDGCWATGGCCCAHAYRTT-3′。PCR反應(yīng)程序為94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性40 s，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s，共35個循環(huán)；72 ℃保溫10 min。

關(guān)鍵詞：石榴（Punica granatum L.）；F3H基因；PCR

中圖分類號：S685.99 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）09-2168-03

石榴（Punica granatum L.）為石榴科落葉灌木或小喬木，在中國已有兩千多年的栽培歷史，在長期的自然選擇和人工栽培過程中形成了豐富的遺傳多樣性[1，2]。石榴不僅是人們喜愛的傳統(tǒng)水果，也是一種優(yōu)良的園林綠化樹種。石榴花朵艷麗，其花瓣有單瓣、復(fù)瓣、重瓣、臺閣等不同花型，紅、粉紅、白、黃等不同花色[3]，觀賞價值極高。目前對石榴AFLP[1，2]、ISSR[4]、RAPD[5]、SARP[6]等分子標(biāo)記的研究較多，而對控制石榴花色形成相關(guān)基因的報道較少。類黃酮3-羥化酶（F3H）屬于細(xì)胞色素P450單加氧酶家族，在花色苷生物合成途徑中發(fā)揮重要作用，具有催化多種依賴NADPH或NADH的底物氧化反應(yīng)的功能[7]，可將4，5，7-三羥基黃烷酮（Naringenin）和二氫堪非醇（Dihydrokaempferol， DHK）分別轉(zhuǎn)化成圣草酚（Eriodictyol）和二氫櫟精（Dihydroquercetin，DHQ）后形成不同顏色的花色苷，使植物表現(xiàn)出不同的花色[8]，克隆F3H基因可為研究石榴的花色形成提供分子基礎(chǔ)。本研究以石榴泰山紅品種的花瓣為材料，對F3H基因的PCR擴增條件進行優(yōu)化，從而建立高效特異的石榴F3H基因PCR擴增體系，為后續(xù)石榴花色形成機理研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

于2012年5～6月從山東省果樹研究所石榴種質(zhì)資源圃采集泰山紅石榴的花瓣，放入液氮速凍后放入-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA的提取結(jié)果

2.2 引物對的篩選

2.3 退火溫度的優(yōu)化

3 討論

PCR是基因分離、克隆和核酸序列分析等分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)，影響PCR產(chǎn)物特異性和得率的因素很多[9]，如退火溫度、退火和延伸時間、引物和酶的濃度、Mg2+的濃度等，所以對不同的基因來說，應(yīng)根據(jù)實際情況對PCR條件進行優(yōu)化。

目前石榴F3H基因序列還沒有報道，因而無法獲得該基因的特異引物。簡并PCR技術(shù)利用引物序列的6個簡并性堿基，擴增位點多，沒有物種特異性，與DNA的復(fù)雜程度無關(guān)[10]。本研究以GenBank中登錄的其他物種的F3H基因保守區(qū)域的核苷酸序列為參考，設(shè)計不同的簡并引物進行PCR擴增，由于引物的簡并性，使得擴增的特異性有所降低，因而必須對使用的引物進行篩選，以獲得最佳擴增引物。

在PCR擴增過程中，退火溫度取決于引物長度、序列、堿基組成和引物的濃度[11]。較高的退火溫度會使模板復(fù)性的準(zhǔn)確性提高，從而提高擴增的特異性，但是溫度過高會使得引物與模板親和力變小，以致不能結(jié)合，得不到擴增產(chǎn)物；而溫度過低又有可能出現(xiàn)非特異性擴增。另外，由于理論預(yù)測與實驗差別較大，所以不同的引物適宜的退火溫度不同，在PCR擴增時有必要進行最佳退火溫度的確定。

本研究在對PCR引物進行篩選時，發(fā)現(xiàn)F1R2和F2R2這兩對引物均能擴增得到目的片段，其中F1R2引物在50 ℃的退火溫度下的PCR擴增產(chǎn)物具有特異性，但產(chǎn)量很低，不利于后續(xù)實驗的進行。而F2R2引物在50 ℃的退火溫度下有非特異性擴增產(chǎn)物，通過提高退火溫度減少非特異性擴增，取得了較好的擴增效果。實驗結(jié)果表明，適合石榴花瓣F3H基因PCR擴增的正反向引物分別為5′-CGTNGAYGTBGTBGTBGCSKCVTC-3′，5′-TCHCCD

GCWATGGCCCAHAYRTT-3′，PCR反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性40 s，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s，共35個循環(huán)；72 ℃保溫10 min。

參考文獻：

[1] 苑兆和，尹燕雷，朱麗琴，等.山東石榴品種遺傳多樣性與親緣關(guān)系的熒光AFLP分析[J]. 園藝學(xué)報，2008，35（1）：107-112.

[2] YUAN Z， YIN Y， QU J， et al. Population genetic diversity in Chinese pomegranate （Punica granatum L.） cultivars revealed by fluorescent-AFLP markers[J]. Journal of Genetics and Genomics， 2007，34（12）：1061-1071.

[3] 汪小飛，周耘峰，黃 埔，等.石榴品種數(shù)量分類研究[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，43（5）：1093-1098.

[4] 趙麗華，李名揚，王先磊，等. 石榴種質(zhì)資源遺傳多樣性及親緣關(guān)系的ISSR分析[J]. 果樹學(xué)報，2011，28（1）：66-71.

[5] 張四普.石榴優(yōu)異資源的調(diào)查收集和RAPD鑒定方法的研究[D].鄭州：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004.

[6] 張四普，汪良駒，曹尚銀，等.23個石榴基因型遺傳多樣性的SRAP分析[J].果樹學(xué)報，2008，25（5）：655-660.

[7] WERCK-REICHHART D，F(xiàn)EYEREISEN R. Cytochromes P450： A success story[J]. Genome Biol，2000，1（6）：1-9.

[8] DOOSTDAR H， SHAPIRO J P， NIEDZ R， et al. A cytochrome P450 mediated naringenin 3′-hydroxylase from sweet orange cell cultures[J]. Plant and Cell Physiology，1995，36（1）：69-77.

[9] INNIS M A， GELFAND D H， SNINSKY J J， et al. PCR Protocols： A Guide to Methods and Applications[M]. UT， Salt Lake City： Academic Press，1990.

[10] 張偉偉，張衍梅，趙 剛，等. DOP-PCR陰性對照中的產(chǎn)物分析及引物濃度的優(yōu)化[J]. 武漢大學(xué)學(xué)報（理學(xué)版），2006，52（2）：220-224

[11] SAIKI R K. The design and optimization of the PCR[A]. ERLICH H A. PCR Technology： Principles and Applications for DNA Amplification[M]. New York： Stockton Press，1989.