郜旭芳　時(shí)軍霞

摘 要：采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)影響歐李SRAP反應(yīng)體系的5個(gè)因素（模板DNA、Mg2+、dNTPs、引物和Taq DNA聚合酶）、4個(gè)水平進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，適合歐李的SRAP反應(yīng)體系為：2.50 mmol/L Mg2+ ，0.25 mmol/L dNTPs，0.60 μmol/L引物，Taq DNA聚合酶0.50 U，1.00 ng/μl模板DNA，總體積為20 μl。優(yōu)化體系的建立為今后利用SRAP標(biāo)記技術(shù)對(duì)歐李進(jìn)行種質(zhì)遺傳多樣性評(píng)價(jià)、指紋圖譜構(gòu)建、基因組分析、分子標(biāo)記輔助育種和遺傳改良等研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：歐李；SRAP；正交設(shè)計(jì)；優(yōu)化

中圖分類號(hào)：S662.502.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2013）09-0009-03

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為懷柔湯河口采摘的野生歐李幼嫩葉片，液氮處理后，保存于-20℃冰箱備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA提取 采用改良的CTAB方法提取DNA[7]，紫外分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的質(zhì)量。-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 正交設(shè)計(jì) 采用L16（45）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)SRAP反應(yīng)體系中的模板DNA、Mg2+、dNTPs、引物、Taq DNA聚合酶濃度進(jìn)行正交組合方案篩選（表1、表2）。SRAP引物由英駿生物技術(shù)有限公司合成，所用引物為：正向引物me2： 5′-TGAGTCCAAACCGGAGC-3′， 反向引物em1：5′-GACTGCGTACGAATTAAT-3′[8]。

1.2.3 PCR擴(kuò)增 反應(yīng)體系為20 μl，擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，35℃復(fù)性1 min，72℃延伸1 min，5個(gè)循環(huán)；94℃變性1 min，50℃復(fù)性1 min，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，經(jīng)溴化乙錠（EB）染色后于凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。

1.2.4 反應(yīng)體系穩(wěn)定性檢測(cè) 選用篩選出的引物對(duì)不同的野生歐李材料進(jìn)行SRAP擴(kuò)增，檢測(cè)優(yōu)化體系的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 歐李SRAP正交反應(yīng)體系優(yōu)化

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)SRAP-PCR反應(yīng)體系選取me2/em1為引物，以野生歐李基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果見圖1。

2.2 優(yōu)化體系驗(yàn)證

選用篩選出的引物組合me2/em1和優(yōu)化的反應(yīng)體系對(duì)不同歐李野生植物材料進(jìn)行擴(kuò)增。由圖2可知，擴(kuò)增出的條帶清晰、多態(tài)性強(qiáng)、穩(wěn)定性好，說明該正交體系適宜歐李SRAP-PCR擴(kuò)增。

1～11：不同野生歐李樣品

圖2 11種野生歐李SRAP優(yōu)化體系擴(kuò)增結(jié)果

3 討論

SRAP作為一種新型的分子標(biāo)記，具有操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定、高效等特點(diǎn)，適用于遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位、基因克隆等遺傳操作，目前，已在小麥、水稻、牡丹、西瓜、蘋果、棉花、柑橘、櫻桃、葡萄、柿等植物中應(yīng)用[13～15]。SRAP-PCR擴(kuò)增一般需要參考Li和Quiros的固定程序[16]，但其擴(kuò)增結(jié)果受到反應(yīng)條件、擴(kuò)增程序及不同物種的影響[17]，所以，SRAP在不同的物種上應(yīng)用需要進(jìn)行反應(yīng)體系的優(yōu)化。目前，在歐李分子標(biāo)記的研究中尚未見SRAP應(yīng)用的報(bào)道，因此，探索適合該物種的最佳SRAP-PCR反應(yīng)體系至關(guān)重要。

試驗(yàn)結(jié)果表明，歐李SRAP-PCR擴(kuò)增的最佳反應(yīng)體系為2.50 mmol/L Mg2+ ，0.25 mmol/L dNTPs，0.60 μmol/L引物，Taq DNA聚合酶0.50 U， 1.00 ng/μl模板DNA，總體積為20 μl。本試驗(yàn)優(yōu)化的SRAP-PCR反應(yīng)體系穩(wěn)定可靠、擴(kuò)增結(jié)果多態(tài)性好，不僅適用于歐李基因組DNA的SRAP-PCR擴(kuò)增，也為SRAP技術(shù)在歐李種質(zhì)資源鑒定和遺傳多樣性分析等方面的研究奠定了基礎(chǔ)。

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