李娟花

摘 要 目的 研究植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)G-2產(chǎn)鬼臼毒素的影響。方法 采用HPLC法檢測(cè)。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)表明6-芐氨基嘌呤（6-BA）濃度為4 mg/L、萘乙酸（NAA）濃度為4 mg/L、6-BA和NAA濃度比為3：5時(shí)該菌產(chǎn)鬼臼毒素的量分別為： 455.72 %eg/L、450.48 %eg/L、932.39 %eg/L，且6-BA和NAA對(duì)菌絲體的生長(zhǎng)均有促進(jìn)作用。

關(guān)鍵詞 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑 內(nèi)生真菌 生物合成 鬼臼毒素

藥用植物桃兒七是我國(guó)一級(jí)保護(hù)植物為小檗科鬼臼屬植物桃兒七的根及根狀莖，是我國(guó)特有種，主要分布于陜西、甘肅、青海、四川、云南、西藏等地，人工栽培尚未規(guī)?；幉闹饕獊?lái)源于野生，多年生草本植物，屬于“太白七藥”之一，具有良好的抗癌作用。其主要藥用成分是以鬼臼毒素為代表的木脂素類(lèi)化合物，具有顯著的抗腫瘤活性以及治療尖銳濕疣和抑菌等作用。

目前用微生物發(fā)酵的方法生產(chǎn)鬼臼毒素，是解決藥源問(wèn)題的有效途徑。提高內(nèi)生菌產(chǎn)鬼臼毒素的產(chǎn)量是人們關(guān)注的熱點(diǎn)。有人發(fā)現(xiàn)將植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑加入細(xì)胞培養(yǎng)物中可顯著提高細(xì)胞中鬼臼毒素的產(chǎn)量，但這些研究主要集中在細(xì)胞培養(yǎng)方面，將植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑加入內(nèi)生真菌細(xì)胞發(fā)酵液中研究其對(duì)鬼臼毒素含量變化的影響國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究在內(nèi)生真菌發(fā)酵指數(shù)期加入植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，研究其對(duì)鬼臼毒素含量變化的影響，為提高鬼臼毒素的產(chǎn)量提供一種新的方法。

一、材料與方法

（一）材料

菌種 桃兒七內(nèi)生真菌G-2，由陜西國(guó)際商貿(mào)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯200.0 g，葡萄糖20.0g， MgSO4 ·7H2O 3.0 g，KH2 PO4 5 .0g，VB 1 10.0mg，瓊脂粉12g，pH自然。

發(fā)酵培養(yǎng)基：馬鈴薯200.0g，葡萄糖40.0g，蛋白胨5.0g，酵母膏0.8g，（NH4） 2SO4 3.0g，KH2PO4 2.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，VB1 10.0mg，水1000.0mL，pH自然。

設(shè)備 高效液相色譜儀；紫外檢測(cè)器；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

（二）方法

液體發(fā)酵 挑取0.5 cm2活化菌種接到液體培養(yǎng)基中，28℃ 靜置培養(yǎng)24 h，轉(zhuǎn)入28 ℃，160 r/min振蕩培養(yǎng)，待菌絲體生長(zhǎng)至指數(shù)期時(shí)向發(fā)酵液中加入不同濃度的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑進(jìn)行培養(yǎng)。

分離提取 用布什漏斗抽濾過(guò)濾發(fā)酵液，菌絲球凍融（-20℃），菌液稱(chēng)量體積。取菌液于45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至1/10體積后，加入等體積的氯仿進(jìn)行萃取，收集氯仿相；菌絲體烘干，放入研缽研磨至菌絲體完全破碎，然后加入一定量的氯仿超聲波提取3次，每次30min，收集氯仿相。合并氯仿相，并于60℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用無(wú)水乙醇溶解后定容至10ml，置4℃冰箱保存，備用。

分析檢測(cè) 標(biāo)品用甲醇定容，配置成0.01-0.08 mg/mL的梯度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。色譜條件：色譜柱采用C18（4.6mm？50mm，5%em），紫外檢測(cè)波長(zhǎng)290nm，流動(dòng)相為：乙腈：水=45：55，設(shè)置流速為1ml/min。精密稱(chēng)取鬼臼毒素標(biāo)準(zhǔn)品約2 mg，甲醇定容至10 mL，得母液濃度為0.2 mg/mL，將母液依次稀釋成濃度梯度為0.08 mg/mL、0.04 mg/mL、0.02 mg/mL、0.01 mg/mL，取20 %eL進(jìn)樣（N=4），得回歸方程為 y=6.0453+3726.3824x，r=0.9994建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，采用外標(biāo)法測(cè)定發(fā)酵產(chǎn)物抽提物中鬼臼毒素產(chǎn)量。

二、結(jié)果與分析

6-BA對(duì)G-2生物合成鬼臼毒素的影響

內(nèi)生真菌G-2液體發(fā)酵至7d時(shí)，加入不同濃度的6-BA，研究其對(duì)生物合成鬼臼毒素的影響。結(jié)果見(jiàn)圖1所示。

圖1表明，在使用6-BA誘導(dǎo)G-2生物合成鬼臼毒素時(shí)，鬼臼毒素的產(chǎn)量隨6-BA濃度的增大而增加。當(dāng)6-BA的濃度達(dá)到4.0 mg/L時(shí)，鬼臼毒素產(chǎn)量達(dá)到峰值，即455.72 %eg/L。相比本底水平鬼臼毒素的產(chǎn)量增加不明顯。當(dāng)6-BA濃度繼續(xù)增大，鬼臼毒素的產(chǎn)量隨之減小。結(jié)果表明，發(fā)酵液中6-BA濃度0～5.0 mg/L濃度范圍內(nèi)，6-BA對(duì)鬼臼毒素的生物合成有促進(jìn)作用，但影響不明顯，但6-BA的加入對(duì)菌絲體生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。

NAA對(duì)G-2生物合成鬼臼毒素的影響

內(nèi)生真菌G-2液體發(fā)酵至7d時(shí)，加入不同濃度的NAA，添加范圍是0～5 mg/L，研究其對(duì)生物合成鬼臼毒素的影響。結(jié)果見(jiàn)圖2所示。

圖2表明，在使用NAA誘導(dǎo)G-2生物合成鬼臼毒素時(shí)，發(fā)酵液中鬼臼毒素的產(chǎn)量隨NAA濃度的增大而增加，當(dāng)NAA的濃度達(dá)到4.0 mg/L時(shí)，鬼臼毒素的產(chǎn)量達(dá)到峰值，即450.48 %eg/L。相比本底水平，鬼臼毒素的產(chǎn)量增加不明顯。當(dāng)NAA濃度繼續(xù)增大，發(fā)酵液中鬼臼毒素的產(chǎn)量隨之減小。結(jié)果表明，在NAA濃度0～5.0 mg/L范圍內(nèi)，NAA對(duì)鬼臼毒素的生物合成有促進(jìn)作用，但影響不明顯，但NAA的加入對(duì)菌絲體生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。

不同混合濃度6-BA 和NAA對(duì)G-2生物合成鬼臼毒素的影響

內(nèi)生真菌G-2液體發(fā)酵至7d時(shí)，加入不同混合濃度的6-BA 和NAA，研究其對(duì)生物合成鬼臼毒素的影響。結(jié)果見(jiàn)圖3所示。

圖3表明，在使用不同混合濃度的6-BA和NAA誘導(dǎo)G-2生物合成鬼臼毒素時(shí)，發(fā)酵液中鬼臼毒素的產(chǎn)量隨不同混合濃度比例發(fā)生變化，當(dāng)6-BA和NAA的濃度比例為3：5時(shí)，鬼臼毒素的產(chǎn)量達(dá)到峰值，即932.39 %eg/L。相比本底水平，鬼臼毒素的產(chǎn)量增加明顯。

三、討論

植物內(nèi)生真菌是一類(lèi)應(yīng)用前景廣闊的資源微生物，用微生物發(fā)酵方法生產(chǎn)鬼臼毒素，是解決藥源問(wèn)題的有效途徑，且提高內(nèi)生真菌產(chǎn)鬼臼毒素的量是目前研究的熱點(diǎn)。

本研究通過(guò)在桃兒七內(nèi)生真菌液體發(fā)酵過(guò)程中添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，研究對(duì)G-2生物合成的鬼臼毒素影響。表明6-BA和NAA，6-BA和NAA不同混合濃度對(duì)G-2生物合成鬼臼毒素也有一定的促進(jìn)作用，并且6-BA和NAA都可以促進(jìn)G-2菌絲體的生長(zhǎng)。

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