姜 燕，沈 鳳，尹芳緣，陳裕泉，惠國華*

(1.浙江工商大學食品與生物工程學院，杭州310035;2浙江大學生物醫(yī)學工程與儀器科學學院，杭州310027)

近年來，檢測細胞化學靈敏性和生物活性的檢測技術成為研究的焦點?，F(xiàn)有檢測方法，諸如熒光成像法、放射性分析等，不但對實驗室檢測環(huán)境有嚴格的要求，而且所需儀器設備、試劑成本較高［1-2］。此外，這些技術在連續(xù)檢測方面存在一定的不足，難以實現(xiàn)特定時間內細胞活動情況的及時跟蹤的目標。細胞傳感器吸引了許多研究人員的注意力，該技術使用活細胞作為敏感元件，通過物質與細胞間的生化反應來實現(xiàn)檢測物信息的標定［3-6］。電化學阻抗譜傳感器是細胞傳感器研究中的典型應用，在細胞貼附和活動檢測、藥物分析、毒理評估等領域有廣泛應用［7-14］。劉清君等以微電極陣列(MEA)的阻抗分析，實現(xiàn)了KYSE 30細胞的貼附、散布、增殖等形態(tài)學變化。并采用抗癌藥物Cisplatin作用于細胞，實驗結果表明該方法為癌癥研究提供了一種新技術［15］。微電極陣列的制備成本較高，Ding等人研究了一種基于絲網(wǎng)印刷電極的K562 Leukaemia細胞貼附和增殖電阻抗譜檢測方法［16］。絲網(wǎng)印刷電極成本低，在實驗中一次性使用，可有效的降低檢測成本。但是電化學阻抗譜分析儀器往往具有體積較大、價格昂貴等特點，難以滿足現(xiàn)場快速檢測的需要。

聲表面波(SAW)技術誕生于20世紀70年代，該方法為制作尺寸小、高靈敏度、高集成度的檢測設備提供了基礎［17-21］。目前已有許多基于聲表面波器件的檢測應用報道［22-24］，如牛奶中細菌的檢測［25］，細菌生長情況監(jiān)測［26］，血漿中鹽分分析［27-28］，有機農藥檢測［29］，尿液分析［30］，液相金屬離子檢測［31］，濕度檢測［32］等領域。

基于以上分析，我們提出一種用于細胞濃度檢測的高頻串聯(lián)聲表面波諧振器傳感系統(tǒng)，將小鼠腸道內分泌腫瘤細胞STC-1懸液滴凃于絲網(wǎng)印刷碳電極之上，將絲網(wǎng)印刷電極與433 MHz的聲表面波諧振器串聯(lián)。使用頻率計記錄檢測數(shù)據(jù)并通過RS-232通訊口傳輸至電腦。實驗結果表明構建的檢測系統(tǒng)實現(xiàn)了STC-1細胞懸液濃度檢測。

1 檢測系統(tǒng)及實驗

1.1 實驗試劑

DMEM高糖培養(yǎng)液(1×)(吉諾生物醫(yī)藥技術有限公司);FBS(Fetal Bovine Serum)(吉諾);L-谷氨酰胺溶液(200 mmol/L，100×)(吉諾);PBS(1×)(吉諾);無水乙醇(AR)(成都市科龍化工試劑廠);75%酒精溶液;無菌水;0.25%胰酶溶液(1×)(吉諾);4%多聚甲醛(PFA);Triton X-100(Washington);2%BSA;緩沖甘油;25%戊二醛溶液(上海化工試劑采購供應五聯(lián)化工廠)。

1.2 實驗儀器

數(shù)顯鼓風干燥箱(GZX-9070，MBE);超凈工作臺(蘇州凈化儀器有限公司);CO2培養(yǎng)箱(SHEL，LAB);冰箱(BCD-196F，青島海爾股份有限公司);倒置生物顯微鏡(XD-101);實體顯微鏡(Leica，MZ16A);CCD數(shù)碼攝像頭(Leica，DFC490);激光共聚焦顯微鏡(Leica，SP2);電子分析天平(PB 203-N，Mettler Toledo);微處理 pH 計(pH211，HANNA Instruments);低速離心機(Anke，TDL-60B);IB-5型離子濺射儀;XL30型環(huán)境掃描電鏡(荷蘭Philips公司);數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海錦屏儀器儀表有限公司)。

1.3 STC-1細胞懸液制備

實驗采用小鼠腸道內分泌細胞系STC-1細胞。細胞培養(yǎng)液采用向DMEM高糖培養(yǎng)基中加入10%FBS、2%谷氨酰胺和1%雙抗，再用0.22 μm的濾膜過濾除菌，最后分裝備用。采用顯微鏡觀察原始STC-1細胞懸液濃度為1×106cell/mL，采用細胞培養(yǎng)液將原始細胞懸液稀釋為 5×105cell/mL，2.5×105cell/mL，1.25×105cell/mL，1×105cell/mL。取每種濃度細胞懸液100 μL滴凃于絲網(wǎng)印刷電極表面用于實驗。

1.4 聲表面波檢測系統(tǒng)構成

圖1(a)為檢測系統(tǒng)結構示意圖，主要包括絲網(wǎng)印刷碳電極(ASTech 125，亞泰博科技術股份有限公司)、聲表面波諧振器及負載電路、穩(wěn)壓電源(DF1741SB3A，寧波中策電子股份有限公司)、通用計數(shù)器(EE3386，江蘇新電聯(lián)科技股份有限公司)。聲表面波諧振器及負載電路由本實驗室自主開發(fā)，選用ST切型石英作為壓電基底材料，采用精密光刻工藝制備頻率為433 MHz的高頻單端聲表面波諧振器，如圖1(b)和1(c)所示。

圖1 檢測系統(tǒng)結構示意圖

聲表面波諧振器負載絲網(wǎng)印刷電極的等效電路如圖2所示，C0為靜態(tài)電容，Ls、Cs與Rs分別為聲表面波諧振器的動態(tài)電感、動態(tài)電容與動態(tài)電阻。當絲網(wǎng)印刷碳電極與諧振器串聯(lián)之后，Ce與Re分別是絲網(wǎng)印刷碳電極的等效電容與等效電阻。聲表面波諧振器負載絲網(wǎng)印刷電極的頻率計算為:

圖2 聲表面波諧振器負載絲網(wǎng)印刷電極等效模型

2 實驗結果

各個細胞懸液的聲表面波串聯(lián)諧振頻率響應如圖3所示，該傳感器對不同濃度的細胞懸液有靈敏的響應。圖3(a)為無細胞的空白電極的頻率響應，空白頻率穩(wěn)定在312.25 MHz。聲表面波諧振器頻率為433 MHz，由于串聯(lián)入絲網(wǎng)印刷電極等因素引起頻率下降，重新裝312.25 MHz建立新的平衡點。圖3(b)為扣除空白后的1×105cell/mL懸液的頻率曲線，頻率大致在1 281.6 MHz附近波動。同樣的，1.25×105cell/mL、2.5×105cell/mL、5.0×105cell/mL、1.0×105cell/mL的聲表面波諧振頻率分別1 292.2 MHz、1 295.2 MHz、1 296.4 MHz、1 308.5 MHz附近波動，在隨著細胞懸液濃度的上升，聲表面波串聯(lián)諧振器的頻率上升。細胞懸液和聲表面波諧振頻率關系如圖4所示。

圖3 STC-1細胞懸液濃度檢測結果

圖4 STC-1細胞懸液濃度檢測模型

根據(jù)圖4，我們可以得到聲表面波諧振器頻率與細胞懸液濃度間線性擬合回歸關系為:

其中Frequency代表聲表面波諧振器頻率，Cellcon代表STC-1細胞懸液濃度。因此，一定范圍內的細胞懸液濃度可以通過式(2)進行預測:

基于以上分析，聲表面波串聯(lián)諧振器傳感系統(tǒng)檢測頻率與細胞懸液濃度之間有著一定的對應關系，這為開發(fā)出一種新型的微型化細胞傳感技術提供了技術可行性，如新型抗癌藥物對癌細胞的靶向藥理作用、味覺受體細胞對味質分子刺激的特異性響應等。

3 結語

本文探索了一種基于串聯(lián)聲表面波諧振器的細胞懸液濃度分析方法。將絲網(wǎng)印刷碳電極與真空封裝的433 MHz聲表面波諧振器串聯(lián)作為檢測元件。將不同濃度的STC-1細胞懸液滴凃在絲網(wǎng)印刷碳電極表面用于實驗。由于電極表面有不同濃度的細胞存在，因此絲網(wǎng)印刷電極的極間電阻等參數(shù)產生了相應的變化，最終影響到聲表面波諧振器的輸出頻率。實驗結果驗證細胞懸液濃度與輸出頻率之間具有一定的線性關系。相比較與電化學阻抗譜等研究方法，本研究為細胞傳感器的小型化提供了研究基礎。同時，絲網(wǎng)印刷碳電極具有生物相容性好、成本低、一次即拋、可工業(yè)化批量生產等優(yōu)勢，這也是本研究的一個顯著特色。我們將開展一項長期的計劃以探索該檢測方法在生物傳感檢測中的應用。

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