對(duì)象和方法

研究對(duì)象按患者蛋白尿的程度將患者分為兩組：活動(dòng)性FSGS組(FSGS-A組)98例，患者尿蛋白定量>3.5 g/24h；非活動(dòng)性FSGS組(FSGS-NA組)94例，患者尿蛋白定量<0.4 g/24h。

FSGS治療組：41例初次接受60 mg足量激素治療的FSGS患者，激素治療8周，留取治療前后尿液標(biāo)本，其中26例激素治療有效，15例激素治療無(wú)效。

疾病對(duì)照組：膜性腎病(MN)，分為MN活動(dòng)組(MN-A組)29例，患者尿蛋白>3.5 g/24h ； MN非活動(dòng)組(MN-NA組)26例，患者尿蛋白<0.4 g/24h。糖尿病腎病(DN)，分為DN活動(dòng)組(DN-A組) 23例，患者尿蛋白>3.5 g/24h；DN非活動(dòng)組(DN-NA組) 27例，患者尿蛋白<0.4 g/24h。

正常對(duì)照組(NC組)：共94例，年齡性別與患者年齡、性別匹配，全身無(wú)器質(zhì)及功能性疾病。

記錄性別、年齡、尿蛋白、尿N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)、尿視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)、血白蛋白、血清肌酐(SCr)、血胱抑素C(CysC)、血總膽固醇、三酰甘油等臨床資料。采用MDRD4估算腎小球?yàn)V過率(eGFR)，eGFR=186×SCr-1.154×年齡-0.203×(0.742，女性)[7]。所有標(biāo)本留取都根據(jù)倫理委員會(huì)的標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)過本人的同意。

RNA提取方法送檢TaqMan低密度芯片尿標(biāo)本RNA的提取：每組每例取等量尿液上清混合后(每組共100 ml尿液上清)使用Trizol(Invitrogen公司)法提取總RNA，即每份血漿中加入兩倍體積的Trizol，然后進(jìn)行2次酚/氯仿抽提，得到的RNA用20 μl DEPC水溶解后送Invitrogen公司行microRNA低密度芯片檢測(cè)[8]。尿液?jiǎn)蝹€(gè)樣本miRNAs提取方法：取300 μl樣品加入100 μl DEPC水，充分混勻后加入等體積的酸性酚(pH 4.7～5.5)和氯仿，酸性酚氯仿體積1∶1，進(jìn)行抽提，后續(xù)抽提方法同血清中提取RNA方法一致[9]，RNA用10 μl DEPC水溶解，-80℃保存。

miRNA RT-PCR和quantitative Real-time實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR) 采用探針法檢測(cè)尿中的miRNAs的含量，探針購(gòu)于Applied Biosystems(Foster City,CA,USA)。逆轉(zhuǎn)錄酶及taq聚合酶購(gòu)于takara。逆轉(zhuǎn)錄使用RNA 2 μl，所得到的cDNA于-20℃保存?zhèn)溆?。定量PCR每反應(yīng)體系使用不稀釋的cDNA 1 μl。所有的PCR反應(yīng)均行3副孔。qRT-PCR采用ABI Prism 7900 定量PCR儀器進(jìn)行檢測(cè)。CT值越大表示含量越低[10]。

他的聲調(diào)，陰沉沉的，干巴巴的，完全沒有感情。他冷冷地說著這些話；前面的那個(gè)只顧一瘸一拐地向流過巖石、激起一片泡沫的白茫茫的小河里走去，一句話也不回答。

TaqMan microRNAarray檢測(cè)將提取的尿液上清總RNA送invitrogen公司行TaqMan低密度芯片檢測(cè)。芯片版本為TaqMan Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0，可檢測(cè)754個(gè)人類miRNA分子，采用7900HT PCR 系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)(Applied biosystems)。以U6為內(nèi)參，2-ΔΔCT計(jì)算各miRNAs的變化倍數(shù)，選取CT>30且FSGS組尿液上清中miRNAs較正常對(duì)照組升高>2倍的miRNAs進(jìn)行后續(xù)的驗(yàn)證。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有的數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行處理。本研究中臨床指標(biāo)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；各組之間miRNAs表達(dá)水平用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差示，比較采用Nonparametric Mann—Whitney U檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Spearman檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

篩選和驗(yàn)證FSGS疾病活動(dòng)相關(guān)的miRNAs FSGS患者臨床資料見表1和表2。

表1 芯片檢測(cè)及初步篩選FSGS患者的臨床資料

表2 大樣本驗(yàn)證FSGS患者的臨床資料

芯片篩選與FSGS活動(dòng)性相關(guān)的miRNAs 實(shí)驗(yàn)采用低密度芯片檢測(cè)FSGS患者尿液上清中循環(huán)microRNAs表達(dá)譜，檢測(cè)分為三組：FSGS-A，F(xiàn)SGS-NA和NC組。三組患者的具體信息見表1。在芯片檢測(cè)的754種miRNAs中，F(xiàn)SGS-A組，F(xiàn)SGS-NA組和NC患者分別檢測(cè)到226種，197種和 173種miRNAs的表達(dá)。miRNAs表達(dá)認(rèn)為具有顯著性差異的標(biāo)準(zhǔn)：(1) 檢測(cè)的CT值≤30；(2) 在兩組之間進(jìn)行比較時(shí)，變化倍數(shù)在2倍以上。基于上述的標(biāo)準(zhǔn)，與NC組比較,FSGS-A組患者尿液中，有52種miRNAs表達(dá)升高，111種miRNAs表達(dá)下降；與FSGS-NA組比較，F(xiàn)SGS-A患者尿液中，有32種miRNAs表達(dá)上調(diào)，164種miRNAs表達(dá)下調(diào)。27個(gè)miRNAs在FSGS-A組中比FSGS-NA組和NC組表達(dá)均上調(diào)。

小樣本初步篩選尿液miRNAs的表達(dá) 在初步篩選中對(duì)18例FSGS-A組，14例FSGS-NA組患者和18例NC組對(duì)照的尿液進(jìn)行了qR-PCR測(cè)定。除了FSGS-A組升高的27個(gè)miRNAs，另外miRNA-10a，miRNA-10b，miRNA-21，miRNA-27b，miRNA-29c，miRNA-30a，miRNA-146a，miRNA-155，miRNA-192，miRNA-194，miRNA-196a,miRNA-200a，miRNA-204，miRNA-320也進(jìn)行了測(cè)定[11-13]。 qRT-PCR測(cè)定CT>32或在標(biāo)本中的檢出率<75%認(rèn)為超過準(zhǔn)確的定量范圍，排除后續(xù)的驗(yàn)證。結(jié)果顯示其中miRNA-21、miRNA-146a、miRNA-192、miRNA-199a、miRNA-200a和miRNA-204各組之間表達(dá)水平不存在明顯差異。有6個(gè)miRNAs表達(dá)水平在活動(dòng)組明顯升高，分別是miRNA-196a、miRNA-30a-5p、miRNA-155、miRNA-320、miRNA-135b和miRNA-490。 活動(dòng)性FSGS組與正常組相比，尿液上清miRNA-196a、miRNA-155和miRNA-320尿液上清表達(dá)變化倍數(shù)>5,miRNA-135b、miRNA-490和miRNA-30a的變化倍數(shù)>2，(P均<0.05)；非活動(dòng)性FSGS組與正常組相比，尿液上清miRNA-30a、miRNA-155和miRNA-320的水平明顯升高(P<0.05)，其中miRNA-155的變化最為明顯，變化倍數(shù)>5(圖1)。據(jù)此，選定miRNA-196a，miRNA-30a-5p，miRNA-155，miRNA-320，miRNA-135b和miRNA-490進(jìn)行后續(xù)大樣本的驗(yàn)證。

圖1 尿液miRNAs的表達(dá)水平的比較

大樣本尿液miRNAs表達(dá)的驗(yàn)證 大樣本驗(yàn)證階段對(duì)80例FSGS-A組，80例FSGS-NA組和76例NC組患者尿液miRNA-196a，miRNA-30a-5p，miRNA-155，miRNA-320，miRNA-135b和miRNA-490的水平進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果顯示，尿液miRNA-135b和miRNA-320的水平在樣本增大之后，各組間無(wú)明顯的差異。miRNA-196a，miRNA-30a-5p，miRNA-155和miRNA-490的水平在FSGS-A組尿液中的水平顯著高于FSGS-NA組和對(duì)照組(P<0.001)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：miRNA-155在尿液上清中的含量最高，miRNA-490的含量最低。尿液上清miRNA-196a和miRNA-30a的水平在FSGS-NA組和NC組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而尿液上清miRNA-155和miRNA-490的水平，不僅FSGS-A組顯著高于FSGS-NA組和NC組(P<0.001)，而且FSGS-NA組顯著高于NC組(P<0.05)。與NC組相比，F(xiàn)SGS-A組尿液上清miRNA-196a，miRNA-30a，miRNA-155和miRNA-490的變化倍數(shù)分別是7.58，2.52，7.72，6.11；與正常組相比，F(xiàn)SGS-NA組尿液上清miRNA-196a，miRNA-30a，miRNA-155和miRNA-490的變化倍數(shù)分別是1.24，0.8，2.38，1.61(圖2)。驗(yàn)證結(jié)果顯示，尿液miRNAs在FSGS疾病活動(dòng)狀態(tài)下顯著升高，疾病緩解狀態(tài)時(shí)水平較活動(dòng)組下降，提示尿液miRNAs可能與疾病活動(dòng)性相關(guān)。

圖2 尿液上清miRNA-196a,miRNA-30a,miRNA-155and miRNA-490的表達(dá)變化

尿液miRNAs水平與臨床指標(biāo)之間的關(guān)系本研究結(jié)果顯示，尿液miRNA-196a，miRNA-30a，miRNA-155和miRNA-490的水平在FSGS-A組患者顯著高于NC組和FSGS-NA組的患者，進(jìn)一步分析miRNA-196a，miRNA-30a，miRNA-155和miRNA-490的升高倍數(shù)與患者臨床指標(biāo)之間的關(guān)系驗(yàn)證miRNAs水平與FSGS活動(dòng)性之間的關(guān)系。結(jié)果顯示，尿液miRNAs的水平與蛋白尿正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別是miRNA-196a(r=0.622,P<0.01)，miRNA-30a(r=0.561,P<0.01)，miRNA-155(r=0.363,P<0.01)和miRNA-490(r=0.624,P<0.01)(圖3)；尿液miRNAs的水平與血清白蛋白水平負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別是miRNA-196a(r=-0.608,P<0.01)，miRNA-30a(r=-0.544,P<0.01)，miRNA-155(r=-0.361,P<0.01)和miRNA-490(r=-0.591,P<0.01)(圖4)；此外，尿液miRNAs水平與總膽固醇水平正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別是miRNA-196a(r=0.568,P<0.01)，miRNA-30a(r=0.556,P<0.01)，miRNA-155(r=0.404,P<0.01)和miRNA-490(r=0.554,P<0.01)；與三酰甘油的水平也存在正相關(guān)性，分別是miRNA-196a(r=0.485,P<0.01)，miRNA-30a(r=0.421,P<0.01)，miRNA-155(r=0.228,P<0.01)和miRNA-490(r=0.483,P<0.01)。相關(guān)性分析顯示，尿液miRNA-196a，miRNA-30a，miRNA-155和miRNA-490的變化水平與患者尿蛋白、白蛋白、膽固醇、三酰甘油等臨床特征性指標(biāo)相關(guān)性良好。

FSGS患者尿液miRNAs表達(dá)的特異性

臨床資料 作為疾病對(duì)照的MN和DN患者的基本情況見表3。

圖3 尿液miRNAs水平與尿蛋白之間的相關(guān)性

圖4 尿液miRNAs水平與血清白蛋白之間的相關(guān)性

表3MN和DN患者的臨床資料

MN:膜性腎??；DN：糖尿病腎??；eGFR:估算的腎小球?yàn)V過率；MN-A組：活性性MN組；MN-NA組：非活動(dòng)性MN組；DN-A組：活動(dòng)性DN組；DN-NA組：非活動(dòng)性DN組

MN和DN患者尿液miRNA-196a、miRNA-30a、miRNA-155和miRNA-490表達(dá)變化 為了進(jìn)一步明確FSGS尿液miRNAs變化的疾病特異性，因此實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步評(píng)估了miRNA-196a、miRNA-30a、miRNA-155和miRNA-490在MN和DN尿液中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示：在MN和DN患者尿液miRNA-196a、miRNA-30a和miRNA-490在MN-A組和MN-NA組CT值下降表明其表達(dá)水平在MN-A組和MN-NA組均明顯高于NC組(P<0.001)，但是在MN-A和MN-NA組之間不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；尿液miRNA-196a、miRNA-30a和miRNA-490的表達(dá)變化在DN中與MN相同；但是miRNA-196a、miRNA-30a和miRNA-490的變化趨勢(shì)MN、DN患者與FSGS患者不同。尿液miRNA-155的水平在MN患者和DN患者中變化相同，在MN-A和DN-A組尿液中miRNA-155的水平不僅顯著高于正常組，且顯著高于MN-NA和DN-NA組(P<0.05)，與其在FSGS患者尿液中的變化相同(圖5)。上述結(jié)果顯示，尿液miRNA-196a、miRNA-490和miRNA-30a的在FSGS中的變化與NN和DN不相同，在FSGS患者中活動(dòng)性的患者中變化明顯。

FSGS患者尿液miRNAs的表達(dá)變化與治療的關(guān)系

臨床資料 治療組患者臨床資料見表4。接受足量激素治療的FSGS患者26例激素治療有效，15例激素治療無(wú)效。

圖5 MN和DN患者尿液miRNA-196a，miRNA-30a，miRNA-155和miRNA-490的表達(dá)情況

表4FSGS患者激素治療前后臨床資料的比較

FSGS：局灶節(jié)段性腎小球硬化：eGFR：估算的腎小球?yàn)V過率

FSGS患者激素治療前后尿液miRNAs的改變 為了評(píng)估同一個(gè)FSGS患者在治療前后的尿液miRNAs水平的改變，我們測(cè)定了41例FSGS患者在接受足量激素治療前后尿液miRNA-196a、miRNA-30a、miRNA-155和miRNA-490的水平。在激素治療有效的FSGS患者尿液中，miRNA-196a、miRNA-30a、miRNA-155和miRNA-490治療后CT值上升，表明其表達(dá)水平隨著病情的緩解明顯下降(P<0.001)，與NC組相比，尿液miRNAs水平還是升高的；而激素治療無(wú)效的FSGS患者，miRNA-196a、miRNA-30a、miRNA-155和miRNA-490在治療前后無(wú)明顯的變化(P>0.05)(圖6)。結(jié)果證實(shí)，當(dāng)FSGS患者經(jīng)激素治療有效，上述四個(gè)miRNAs在尿液中的變化與激素治療無(wú)效情況存在明顯差異。

圖6 在激素治療前后尿液miRNA-196a、miRNA-30a、miRNA-155和miRNA-490的表達(dá)變化

討 論

本研究發(fā)現(xiàn)FSGS患者尿液中miRNA-155、miRNA-196a、miRNA-30a、miRNA-490的含量在疾病活動(dòng)狀態(tài)明顯高于疾病緩解狀態(tài)，miRNA-155、miRNA-196a、miRNA-30a、miRNA-490的改變與患者的尿蛋白、血清白蛋白，血脂等臨床指標(biāo)具有很好的相關(guān)性，且治療后，隨著疾病的緩解上述miRNAs水平明顯下降。為了對(duì)其在反映FSGS疾病活動(dòng)中的特異性進(jìn)行驗(yàn)證，我們同時(shí)測(cè)定了MN和DN患者尿液miRNA-155、miRNA-196a、miRNA-30a、miRNA-490的水平，發(fā)現(xiàn)miRNA-196a、miRNA-30a和miRNA-490這三種miRNAs是FSGS特異的標(biāo)志物。因此，有必要在臨床上擴(kuò)大病例，開展前瞻性的研究對(duì)上述標(biāo)志物的臨床應(yīng)用以進(jìn)一步的研究驗(yàn)證。

miRNA-30家族,miR196a、196b在人體的腎臟的含量明顯高于心、肺、肝、脾、結(jié)腸[11]。FSGS患者尿液中miRNA-196a和miRNA-30a含量的增加可能反映了腎臟組織固有細(xì)胞的表達(dá)情況。近期研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-30參與了足細(xì)胞損傷[14]，足細(xì)胞Dicer敲除小鼠的腎小球基因表達(dá)譜芯片顯示在190個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，其中很多是miRNA-30家族的靶基因，推測(cè)miRNA-30家族可能參與了Dicer敲除小鼠的足細(xì)胞損傷的過程[14-16]。FSGS患者腎小球中表達(dá)下降，在嘌呤霉素誘導(dǎo)的大鼠腎病模型中表達(dá)下降，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miRNA-30能通過抑制p53和notch1的激活保護(hù)足細(xì)胞避免損傷。體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，糖皮質(zhì)激素能維持miRNA-30在足細(xì)胞中的表達(dá)，發(fā)揮足細(xì)胞保護(hù)作用(未發(fā)表資料)。

在脊椎動(dòng)物基因組中miRNA-196家族位于HOX基因簇上[17]，miRNA-196的進(jìn)化行為上與HOX基因非常相似[18]，HOX基因與胚胎發(fā)育密切相關(guān)[19],研究證實(shí)miRNA-196a在胚胎發(fā)育中起著重要的作用[20,21]。miRNA-196a還參與了多種腫瘤的病理生理過程，參與調(diào)節(jié)免疫及細(xì)胞的增生[22]。血清miRNA-196a水平在胰腺導(dǎo)管腺癌的患者中顯著升高，腫瘤切除之后表達(dá)水平下降，并且miRNA-196a水平與患者的中位生存時(shí)間相關(guān)[23]，提示血清miRNA-196a可能是診斷的潛在生物標(biāo)志物。在腎透明細(xì)胞癌中，miRNA-196a表達(dá)下調(diào)[24]，在高血壓腎臟病中，miR196a在腎皮質(zhì)中表達(dá)升高，在腎臟髓質(zhì)中無(wú)顯著變化[25]。本研究發(fā)現(xiàn)活動(dòng)性FSGS患者尿液miRNA-196a水平升高，該變化與疾病發(fā)病機(jī)制之間的關(guān)聯(lián)尚需進(jìn)一步研究闡明。

miRNA-155參與多種生理和病理過程，功能包括造血細(xì)胞的分化、免疫、炎癥、腫瘤及心血管疾病等等[26-28]。體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)miRNA-155通過影響Ⅰ型干擾素信號(hào)影響CD8+T細(xì)胞的應(yīng)答和清除病毒的能力[29]。沉默miRNA-155通過上調(diào)腎腫瘤細(xì)胞BACH1，抑制腫瘤細(xì)胞增生和遷移，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[30]，IgA腎病患者腎組織和尿液中miRNA-155的表達(dá)均升高，且與疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)，提示了miRNA-155參與了腎臟細(xì)胞疾病狀態(tài)下的病理過程。在小鼠急性腎損傷模型中，miRNA-155在腎組織中表達(dá)升高，在血清和尿液上清中表達(dá)下降[31]。上述研究結(jié)果提示，miRNA-155是腎組織損傷后一個(gè)共同的反應(yīng)，本研究也表明無(wú)論是FSGS，還是MN和DN，尿液miRNA-155在疾病活動(dòng)情況下均明顯升高。此外，尿液miRNA-155含量的改變不有可能與患者的全身免疫調(diào)節(jié)異常有關(guān)。

目前尚無(wú)關(guān)于miRNA-490在腎臟方面的研究。之前的研究發(fā)現(xiàn)miRNA-490在肝細(xì)胞癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，體外高表達(dá)miRNA-490導(dǎo)致細(xì)胞增生、遷移及浸潤(rùn)能力的增加，有促進(jìn)上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的作用[32]。本研究發(fā)現(xiàn)活動(dòng)性FSGS患者尿液中miRNA-490 水平明顯增高，其在腎臟疾病發(fā)病機(jī)制中的作用值得進(jìn)一步探究。

本研究也存在一些不足之處。首先，未對(duì)患者組織miRNAs譜進(jìn)行檢測(cè)，因此，影響了對(duì)這幾個(gè)miRNAs的變化與FSGS發(fā)病機(jī)制之間的聯(lián)系進(jìn)行討論。其次，缺少FSGS患者血清中miRNAs的同步研究。因此，進(jìn)一步探尋FSGS患者疾病活動(dòng)時(shí)尿液中miRNA-196a、miRNA-30a和miRNA-490這三種miRNAs的來源及其調(diào)控機(jī)制，對(duì)于提高FSGS發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)和上述三種尿液miRNAs的臨床應(yīng)用具有重要的意義。

本研究發(fā)現(xiàn)活動(dòng)性FSGS患者尿液中miRNA-196a、miRNA-30a、miRNA-490水平明顯升高，其水平不僅與疾病活動(dòng)性密切相關(guān)，且與治療反應(yīng)密切相關(guān)，提示尿液中這三種miRNAs，有可能成是判斷FSGS疾病活動(dòng)和觀察療效的生物標(biāo)志物。

1 D’Agati VD,Fogo AB,Bruijn JA,et al.Pathologic classification of focal segmental glomerulosclerosis:a working proposal.Am J Kidney Dis,2004,43(2):368-382.

2 Thomas DB,Franceschini N,Hogan SL,et al.Clinical and pathologic characteristics of focal segmental glomerulosclerosis pathologic variants.Kidney Int,2006,69(5):920-926.

3 Wang G,Tam LS,Li EK,et al.Serum and urinary free microRNA level in patients with systemic lupus erythematosus.Lupus,2011,20(5):493-500.

4 Wang G,Kwan BC,Lai FM,et al.Elevated levels of miRNA-146a and miRNA-155 in kidney biopsy and urine from patients with IgA nephropathy.Dis Markers,2011,30(4):171-179.

5 Wang G,Kwan BC,Lai FM,et al.Intrarenal expression of miRNAs in patients with hypertensive nephrosclerosis.Am J Hypertens,2010,23(1):78-84.

6 Wang G,Kwan BC,Lai FM,et al.Intrarenal expression of microRNAs in patients with IgA nephropathy.Lab Invest,2010,90(1):98-103.

7 Kimmel PL,Emont SL,Newmann JM,et al.ESRD patient quality of life:symptoms,spiritual beliefs,psychosocial factors,and ethnicity.Am J Kidney Dis,2003,42(4):713-721.

8 Zhang C,Wang C,Chen X,et al.Expression profile of microRNAs in serum:a fingerprint for esophageal squamous cell carcinoma.Clin Chem,2010,56(12):1871-1879.

9 Chen X,Ba Y,Ma L,et al.Characterization of microRNAs in serum:a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases.Cell Res,2008,18(10):997-1006.

10 Liu R,Zhang C,Hu Z,et al.A five-microRNA signature identified from genome-wide serum microRNA expression profiling serves as a fingerprint for gastric cancer diagnosis.Eur J Cancer,2011,47(5):784-791.

11 Wang N,Zhou Y,Jiang L,et al.Urinary microRNA-10a and microRNA-30d serve as novel,sensitive and specific biomarkers for kidney injury.PLoS One,2012,7(12):e51140.

12 Ichii O,Otsuka S,Sasaki N,et al.Altered expression of microRNA miRNA-146a correlates with the development of chronic renal inflammation.Kidney Int,2012,81(3):280-292.

13 Lorenzen JM,Kielstein JT,Hafer C,et al.Circulating miRNA-210 predicts survival in critically ill patients with acute kidney injury.Clin J Am Soc Nephrol,2011,6(7):1540-1546.

14 Shi S,Yu L,Chiu C,et al.Podocyte-selective deletion of dicer induces proteinuria and glomerulosclerosis.J Am Soc Nephrol,2008,19(11):2159-2169.

15 Ho J,Ng KH,Rosen S，et al.Podocyte-specific loss of functional microRNAs leads to rapid glomerular and tubular injury.J Am Soc Nephrol,2008,19(11):2069-2075.

16 Harvey SJ,Jarad G,Cunningham J,et al.Podocyte-specific deletion of dicer alters cytoskeletal dynamics and causes glomerular disease.J Am Soc Nephrol,2008,19(11):2150-2158.

17 Woltering JM,Durston AJ.MiRNA-10 represses HoxB1a and HoxB3a in zebrafish.PLoS One,2008,3(1):e1396.

18 Tanzer A,Amemiya CT,Kim CB,et al.Evolution of microRNAs located within Hox gene clusters.J Exp Zool B Mol Dev Evol,2005,304(1):75-85.

19 McGinnis W,Krumlauf R.Homeobox genes and axial patterning.Cell,1992,68(2):283-302.

20 Hornstein E,Mansfield JH,Yekta S,et al.The microRNA miRNA-196 acts upstream of Hoxb8 and Shh in limb development.Nature,2005,438(7068):671-674.

21 Qiu R,Liu Y,Wu JY,et al.Misexpression of miRNA-196a induces eye anomaly in Xenopus laevis.Brain Res Bull,2009,79(1):26-31.

22 Chen C,Zhang Y,Zhang L,et al.MicroRNA-196:critical roles and clinical applications in development and cancer.J Cell Mol Med,2011,15(1):14-23.

23 Kong X,Du Y,Wang G,et al.Detection of differentially expressed microRNAs in serum of pancreatic ductal adenocarcinoma patients:miRNA-196a could be a potential marker for poor prognosis.Dig Dis Sci,2011,56(2):602-609.

24 White NM,Khella HW,Grigull J,et al.miRNA profiling in metastatic renal cell carcinoma reveals a tumour-suppressor effect for miRNA-215.Br J Cancer,2011,105(11):1741-1749.

25 Marques FZ,Campain AE,Tomaszewski M,et al.Gene expression profiling reveals renin mRNA overexpression in human hypertensive kidneys and a role for microRNAs.Hypertension,2011,58(6):1093-1098.

26 Faraoni I,Antonetti FR,Cardone J,et al.miRNA-155 gene:a typical multifunctional microRNA.Biochim Biophys Acta,2009,1792(6):497-505.

27 Lindsay MA.microRNAs and the immune response.Trends Immunol,2008,29(7):343-351.

28 Yang W,Lee DY,Ben-David Y.The roles of microRNAs in tumorigenesis and angiogenesis.Int J Physiol Pathophysiol Pharmacol,2011,3(2):140-155.

29 Gracias DT,Stelekati E,Hope JL,et al.The microRNA miRNA-155 controls CD8(+) T cell responses by regulating interferon signaling.Nat Immunol,2013,14(6):593-602.

30 Li S,Chen T,Zhong Z,et al.microRNA-155 silencing inhibits proliferation and migration and induces apoptosis by upregulating BACH1 in renal cancer cells.Mol Med Rep,2012,5(4):949-954.

31 Saikumar J,Hoffmann D,Kim TM,et al.Expression,circulation,and excretion profile of microRNA-21，-155,and-18a following acute kidney injury.Toxicol Sci,2012,129(2):256-267.

32 Zhang LY,Liu M,Li X,et al.miRNA-490-3p modulates cell growth and epithelial to mesenchymal transition of hepatocellular carcinoma cells by targeting endoplasmic reticulum-Golgi intermediate compartment protein 3(ERGIC3).J Biol Chem,2013,288(6):4035-4047.