李廷山，王 娟，胡小文

(草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室,蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院,甘肅 蘭州 730020)

水分是影響種子萌發(fā)的一個關(guān)鍵因素，種子只有在一定的水分條件下，經(jīng)過充分吸脹后才能萌發(fā)，這一過程由種子與所處環(huán)境介質(zhì)的水勢差決定。一般認(rèn)為，種子只有吸水到一定的臨界點才能萌發(fā)，這個臨界點的水勢叫做基礎(chǔ)水勢，即種子萌發(fā)所需的最低水勢。大量研究發(fā)現(xiàn)[1-2]，當(dāng)外界條件高于臨界水勢時，種子萌發(fā)速率與外界水勢呈線性正相關(guān)，且種子群體的最終萌發(fā)率隨水勢的降低而降低。

基于外界水勢與種子萌發(fā)的關(guān)系，Gummerson[3]提出了水勢模型[方程(1)]。這一模型主要基于以下基本假設(shè)：1)種子萌發(fā)的速率(1/tg,萌發(fā)率達到g時所需時間的倒數(shù))與水勢呈線性正相關(guān)；2)同一種群內(nèi)，所有個體萌發(fā)所需的水勢時間值(θH，MPa.d)為一定值；3)種群內(nèi)個體萌發(fā)要求外界水勢高于基礎(chǔ)水勢(Ψb),但種群內(nèi)個體萌發(fā)所需的基礎(chǔ)水勢存在變異，其變異服從正態(tài)分布[3-6]。

θH=(Ψ-Ψb)tg

(1)

由方程(1)可得：

GRg=1/tg=(Ψ-Ψb)/θH=K+(1/θH)Ψ

(2)

式中，Ψ為萌發(fā)水勢，GRg為萌發(fā)速率。

由此可以看出，種子萌發(fā)速率函數(shù)可用群體內(nèi)基礎(chǔ)水勢的正態(tài)分布函數(shù)來描述。因此，通過函數(shù)變換，可由方程(3)對種子萌發(fā)概率進行模擬:

probit(g)=[Ψ-θH/tg-Ψb(50)]/δΨb

(3)

式中，δΨb為萌發(fā)基礎(chǔ)水勢標(biāo)準(zhǔn)偏差，Ψb(50)為基礎(chǔ)水勢均值。

與傳統(tǒng)的統(tǒng)計分析方法相比，種子萌發(fā)水勢模型量化了水勢對種子萌發(fā)的作用，其參數(shù)具有重要的生理與生態(tài)學(xué)意義。因此，該模型一經(jīng)提出，即被廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物、蔬菜等種子萌發(fā)的生理生態(tài)學(xué)研究中[1-6]。但有關(guān)用水勢模型研究野生豆科植物種子萌發(fā)生態(tài)學(xué)的報道尚不多見。豆科牧草稀少、蛋白來源匱乏是以青藏高原為代表的我國高寒山區(qū)畜牧業(yè)發(fā)展的一個重要限制因素。由于多數(shù)從低海拔地區(qū)引進的優(yōu)良豆科植物在高寒山區(qū)往往不能完成生育期，開發(fā)與利用當(dāng)?shù)匾吧箍浦参锓N質(zhì)資源便成為解決這一限制因素的重要途徑。大量研究表明,種子萌發(fā)與幼苗生長期往往是植物生活史中最為脆弱的階段,研究種子萌發(fā)對環(huán)境的響應(yīng)特性不僅對了解該物種的分布與適應(yīng)具有重要意義,還為其栽培馴化方向提供了重要參考。窄葉野豌豆(Viciaangustifolia)、山野豌豆(V.amoena)、歪頭菜(V.unijuga)以及箭筈豌豆(V.sativa)是分布于我國青藏高原的4種重要豆科野豌豆屬植物，其蛋白含量高，適應(yīng)性強，具有重要的生態(tài)價值與經(jīng)濟價值[7-12]。上述4種植物種子萌發(fā)的最低溫均在5 ℃以下，其中箭筈豌豆種子萌發(fā)的最低溫低至-2 ℃[13]。而在我國青藏高原東緣甘南地區(qū),早春3、4月長年月均溫分別在0、5 ℃左右[10]，表明早春低溫可能不是限制豆科種子在當(dāng)?shù)孛劝l(fā)與幼苗建植的主要因素。由于當(dāng)?shù)亟邓饕杏?-10月，而1-4月降水較少[10]，因此，水分可能在種子萌發(fā)與幼苗建植的過程中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。雖已有許多有關(guān)高寒山區(qū)植物種子萌發(fā)對溫度的響應(yīng)的研究，但鮮有關(guān)于該區(qū)域種子萌發(fā)對水分脅迫響應(yīng)的報道[12]?；诖?，本研究擬以上述4種野豌豆屬植物種子為材料開展以下研究：1)比較4種野豌豆屬植物種子萌發(fā)對水分脅迫的響應(yīng)特性及其生態(tài)學(xué)意義；2)評價水勢模型在不同豆科植物種子萌發(fā)研究上的適用性；3)應(yīng)用水勢模型參數(shù)比較分析4種野豌豆屬植物種子萌發(fā)對水分的需求特性。

1 材料和方法

1.1供試材料 供試種子由農(nóng)業(yè)部牧草與草坪草種子質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心(蘭州)提供，試驗前各樣品貯藏于室溫條件下備用。其中箭筈豌豆為蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院在當(dāng)?shù)剡x育成功的栽培品種“蘭箭3號”(下文均稱蘭箭3號)，其余植物種子均直接采自當(dāng)?shù)氐囊吧参锓N群。為確保種子的代表性，每個種至少采集上百株的植物種子。種子樣品信息詳見表1。

表1 供試種基本信息Table 1 The basic information of testing seed

1.2試驗方法

1.2.1種子預(yù)處理 4種豆科植物種子除蘭箭3號外，窄葉野豌豆、山野豌豆以及歪頭菜種子均用解剖刀切破種皮以破除物理休眠，后貯藏于室溫條件備用。

1.2.2發(fā)芽試驗 在20 ℃條件下，按照Michel和Kaufmann[13]的方法設(shè)置水勢為0、-0.2、-0.4、-0.6、-0.8、-1.0和-1.2 MPa的7個PEG6000溶液。試驗期間，用稱重法測定培養(yǎng)皿質(zhì)量變化，并每天補充因蒸發(fā)而散失的水分，以保持恒定的溶液濃度。試驗在黑暗條件下進行，每個處理4個重復(fù)，每個重復(fù)50粒，以胚根突出種皮視為萌發(fā)，萌發(fā)初始每8 h統(tǒng)計一次發(fā)芽率，發(fā)芽高峰期后,每天統(tǒng)計一次,持續(xù)14 d。

1.2.3數(shù)據(jù)分析

水勢模型參數(shù)的估計：種子萌發(fā)基礎(chǔ)水勢的估計采用兩種方法：1)建立種子萌發(fā)速率(1/t25，1/t50，1/t75)與萌發(fā)水勢的線性回歸方程，回歸直線與X軸的交點即為萌發(fā)基礎(chǔ)水勢；2)通過重復(fù)概率單位回歸分析(Repeated Probit)計算得到萌發(fā)的基礎(chǔ)水勢，水勢時間值代入間隔為0.1 MPa.d，直到所獲回歸方程殘差均方最小[14-15]。然后根據(jù)方程(1)計算水勢時間累積值。

萌發(fā)進程的模擬：根據(jù)重復(fù)概率單位回歸分析獲得的水勢模型參數(shù)建立各水勢條件下種子萌發(fā)進程的預(yù)測方程，并與實際觀測值相比較。

統(tǒng)計與作圖：所有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析均采用SPSS 17.0軟件進行，Excel 2010軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1水分脅迫條件下不同植物種子的萌發(fā)率 4種野豌豆屬植物種子的最終萌發(fā)率均表現(xiàn)出隨水勢降低而降低的趨勢，但種子萌發(fā)對水分脅迫的響應(yīng)有所不同(表2)。無水分脅迫條件下，4種植物種子的初始萌發(fā)率無顯著差異，且均在93%以上。其中，山野豌豆種子萌發(fā)對水分最為敏感，-0.2 MPa水勢即導(dǎo)致其萌發(fā)率顯著下降，而使窄葉野豌豆、歪頭菜與蘭箭3號種子萌發(fā)率顯著下降的水勢分別為-0.6，-0.4與-1.0 MPa。當(dāng)水勢為-1.0 MPa時，山野豌豆的萌發(fā)率為0，窄葉野豌豆、歪頭菜與蘭箭3號的萌發(fā)率則分別為33%、40%與61%；當(dāng)水勢為-1.2 MPa時，窄葉野豌豆與山野豌豆的萌發(fā)率為0，歪頭菜與蘭箭3號種子的萌發(fā)率分別為19%與23%。

2.2基于種子萌發(fā)速率對萌發(fā)基礎(chǔ)水勢的估計 萌發(fā)基礎(chǔ)水勢(Ψb)的估計值受種子萌發(fā)率(g)的影響，呈現(xiàn)出隨萌發(fā)率的增加而增加的趨勢(圖1)。除歪頭菜種子在不同萌發(fā)率條件下，萌發(fā)速率與水勢的回歸直線斜率無顯著差異外，其他3個植物種萌發(fā)速率與水勢的回歸斜率隨萌發(fā)率的增加而降低。

表2 不同水勢條件下4種野豌豆屬植物種子的發(fā)芽率Table 2 Seed germination of four Vicia species under different water potential %

圖1 基于種子萌發(fā)速率與萌發(fā)水勢的線性回歸分析Fig.1 A linear regression of germinafion rate(1/tg) and water poterntial

種子萌發(fā)的基礎(chǔ)水勢均值與水勢時間值因種而異，其中Ψb表現(xiàn)為山野豌豆>窄葉野豌豆>歪頭菜>蘭箭3號；θH表現(xiàn)為歪頭菜>蘭箭3號>窄葉野豌豆>山野豌豆(表3)。

4種豆科牧草種子的萌發(fā)速率隨滲透脅迫的加劇而降低，萌發(fā)速率(1/t50)與水勢之間呈顯著線性正相關(guān)(P<0.05)。其中山野豌豆抗脅迫能力最弱，基礎(chǔ)水勢為-0.72 MPa，蘭箭3號抗脅迫能力最強，基礎(chǔ)水勢為-1.50 MPa(表3)。

2.3基于Probit分析對萌發(fā)基礎(chǔ)水勢的估計 由重復(fù)Probit回歸分析獲得的Ψb值除窄葉野豌豆外，其他3個種均略高于由萌發(fā)速率線性回歸模型外推獲得的值，但二者非常接近，具體表現(xiàn)為山野豌豆 (-0.64)>窄葉野豌豆(-1.29)≥歪頭菜 (-1.29)>蘭箭3號 (-1.36)。從實際觀測值來看，基于Probit法的估計似乎更為準(zhǔn)確，因為在-1.2 MPa條件下，盡管萌發(fā)期長達14 d，蘭箭3號種子的萌發(fā)率并未達到50%，表明估計值要稍低于實際觀測值。θH值表現(xiàn)為歪頭菜(4.3)>蘭箭3號(3.8)>窄葉野豌豆(3.7)>山野豌豆(1.3)，除窄葉野豌豆外，其他3個種均略低于由萌發(fā)速率線性回歸模型外推獲得的值，與Ψb一樣，二者也非常接近(表4)。

表3 基于1/t50與水勢回歸分析估計的4種植物種子萌發(fā)的基礎(chǔ)水勢Table 3 Estimation of base water potential value for 4 Vicia species based on a linear regression of germination rate (1/t50) and water potential

表4 基于重復(fù)Probit回歸估計的萌發(fā)基礎(chǔ)水勢Table 4 Estimation of water potential value based on repeated probit analysis of four Vicia species

2.4基于水勢模型對種子萌發(fā)進程的模擬 在高水勢條件下，水勢模型可以對4種豆科牧草的萌發(fā)進程做出準(zhǔn)確預(yù)測(R2>0.90)。但隨著萌發(fā)水勢的降低，除對歪頭菜的預(yù)測準(zhǔn)確度較高外，對另外3個種的預(yù)測準(zhǔn)確性明顯下降，特別是當(dāng)種子萌發(fā)水勢接近種子萌發(fā)基礎(chǔ)水勢值時，預(yù)測準(zhǔn)確度極低。如窄葉野豌豆種子在-1.0與-1.2 MPa時，預(yù)測值與實際觀測值完全不吻合(圖2，圖3)。

3 討論與結(jié)論

3.1水勢模型基本假設(shè)的檢驗及模型參數(shù)的估計 水勢模型假設(shè)中，種子群體中所有種子能夠萌發(fā)的基礎(chǔ)水勢存在變異，因此，所需達到的種子萌發(fā)率越高，對相應(yīng)的水勢值要求也就越高[16]。與此一致，本研究發(fā)現(xiàn)，隨萌發(fā)率的升高，4種植物種子的基礎(chǔ)水勢均呈現(xiàn)增加趨勢。由于種群所有種子個體萌發(fā)的基礎(chǔ)水勢不同，基于重復(fù)概率單位回歸分析估計的基礎(chǔ)水勢值的實質(zhì)是所有種群種子個體萌發(fā)基礎(chǔ)水勢的均值，理論上應(yīng)等于通過1/t50與萌發(fā)介質(zhì)水勢相關(guān)方程估計的值。本研究結(jié)果表明，盡管兩種估計方法在統(tǒng)計學(xué)上都有較好的表現(xiàn)(較高的決定系數(shù))，但其估計值卻存在不同程度的差異。如利用兩種方法對窄葉野豌豆Ψb值的估計幾乎沒有差異，但對于蘭箭3號種子，基于1/t50的估計值要比Probit法的估計值小0.14 MPa。與此相似，亦有研究認(rèn)為，盡管基于萌發(fā)速率與水勢的回歸關(guān)系外推獲得萌發(fā)基礎(chǔ)水勢值的方法較為簡單易行，但由于這一計算方法所獲溫度閾值是通過建立方程外推而得到，因而無論是從生物學(xué)還是從統(tǒng)計學(xué)的角度，對其結(jié)論的可靠性都應(yīng)慎重對待[17]。基于這一考慮, 在應(yīng)用水勢模型對植物種子萌發(fā)特性進行分析時,以重復(fù)概率單位回歸分析法為佳。

圖2 不同水勢條件下窄葉野豌豆與山野豌豆種子萌發(fā)進程的模擬Fig.2 Observed (symbols) and fitted (lines) water potential of V.angustifolia and V.amoena

圖3 不同水勢條件下歪頭菜與箭蘭3號種子萌發(fā)進程的模擬Fig.3 Observed (symbols) and fitted (lines) water potential of V.unijuga and V.sativa

同時由方程(2)可以得知，種子群體萌發(fā)到一定百分比(g)所需時間的倒數(shù)與外界水勢呈線性負(fù)相關(guān)，這一線性回歸方程的斜率為水勢時間值的倒數(shù)。由于模型假設(shè)種群內(nèi)所有種子個體萌發(fā)所需水勢時間值恒定，因而，以不同萌發(fā)率來表示的萌發(fā)速率與水勢的回歸直線應(yīng)是平行關(guān)系。這一假設(shè)已在其他植物種上得到驗證[17]。但本研究發(fā)現(xiàn)，測試的4個植物種中，除歪頭菜種子表現(xiàn)出這種平行關(guān)系外，其他植物種回歸直線的斜率均表現(xiàn)為隨萌發(fā)率增加而降低的趨勢。一種可能的原因是，豆科植物種子在吸脹后通常具有較快的萌發(fā)速率，相對長的統(tǒng)計時間間隔易于忽略這一過程中種子萌發(fā)與時間的內(nèi)在聯(lián)系。其它原因尚待進一步研究。

3.2種子萌發(fā)對水分脅迫響應(yīng)的種間差異 已有大量研究表明[1-2]，相似生境下的不同物種，其種子萌發(fā)對水分脅迫的響應(yīng)策略也存在一定差異。本研究發(fā)現(xiàn)，參試的4個植物種最終萌發(fā)率對水勢的敏感性存在顯著差異，其中山野豌豆種子對水分脅迫最為敏感，而箭筈豌豆(蘭箭3號)種子萌發(fā)最為耐旱，表明植物在長期的進化或選育過程中，對于水分環(huán)境的選擇在適應(yīng)策略上產(chǎn)生了分化。值得注意的是，盡管高寒草原區(qū)具有比荒漠草原區(qū)更好的水分條件，但在測試的4種植物中，除山野豌豆外，其他3個種的萌發(fā)均表現(xiàn)出較強的耐旱性。這可能與高寒草原區(qū)的氣候特點密切相關(guān)。由于該區(qū)域無霜期較短，在早春能快速出苗的植物客觀上具有較長的適宜生長期，而該區(qū)域早春降水較少，相對干旱。應(yīng)用水勢模型進行分析也發(fā)現(xiàn)，4種植物種子萌發(fā)的Ψb值存在一定差異，其中蘭箭3號種子的Ψb值最低，這一特性有利于種子在相對干旱的環(huán)境條件下累積水勢時間值，從而保證種子在播種后快速出苗。種子對水分與熱量的要求是決定種子萌發(fā)速率的兩個主要因素，利用積溫模型對這4種植物種子萌發(fā)進程的分析表明[12]，相對其他3種野生植物，蘭箭3號具有相對較低的Tb(萌發(fā)最低溫)，這在一定程度上保證了其適于早播的特性；而本研究進一步證明蘭箭3號種子萌發(fā)的Ψb值亦較低，有利于其在相對干旱條件下出苗。與此相反，在參試的4種植物中，山野豌豆種子萌發(fā)的Ψb值要顯著高于其他3種植物，表明該植物種子的萌發(fā)對水分具有較高的要求。在種子的采集過程中，我們發(fā)現(xiàn)山野豌豆主要分布于田埂或河邊，這是否與其種子萌發(fā)對水分的需求有關(guān)還有待進一步研究。但另一方面，山野豌豆種子萌發(fā)需要的θH要顯著低于其他3種植物，表明該種植物在水分充足的條件下，可迅速萌發(fā)；而在水分虧缺的情況下，可能以強迫休眠的狀態(tài)長期貯存于土壤種子庫，以避免可能的干旱風(fēng)險。相對山野豌豆，歪頭菜、窄葉野豌豆采取的適應(yīng)策略則與蘭箭3號較為相似。

3.3種子萌發(fā)進程的模擬 基于水勢模型，可以準(zhǔn)確預(yù)測種子在不同條件下的萌發(fā)進程[18-19]。本研究表明，在較低水勢條件下，水勢模型對于部分種子萌發(fā)進程的預(yù)測準(zhǔn)確度較低(圖2，圖3)。造成這種偏離的原因可能在于，萌發(fā)水勢離Ψb值越接近，由于實驗誤差(如水分的蒸發(fā))帶來的影響也就越大，從而在一定程度上影響了預(yù)測的準(zhǔn)確性。此外，由于豆科種子萌發(fā)相對集中，過長的統(tǒng)計時長(8 h或1 d)易于忽略萌發(fā)過程的變化規(guī)律。但值得注意的是，無論在何種水勢條件下，該模型都能準(zhǔn)確預(yù)測歪頭菜種子的萌發(fā)進程，通過利用1/tg與萌發(fā)水勢的回歸方程，可以檢驗?zāi)Ｐ偷挠嘘P(guān)假設(shè)是否成立。在測試的4個植物種中，模型有關(guān)種群內(nèi)所有個體種子萌發(fā)所需水分時間值恒定(回歸線平行)的假設(shè)在除歪頭菜外的3個種中并不嚴(yán)格成立，造成這種差異的內(nèi)在機制尚需進一步研究。

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