張凌云，師尚禮，尹成學(xué)，崔國忠

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室，中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070； 2.甘肅省酒泉市林果服務(wù)中心，甘肅 酒泉 735000)

俄羅斯雜花苜蓿(Medicagosativasubsp.varia)從俄羅斯赤塔州引進，6年的引種試驗(2001-2006年)證明該品種具有根系發(fā)達、主根入土深、適應(yīng)性強、抗寒、耐旱、返青早、越冬率高及富含蛋白質(zhì)且產(chǎn)量高等特性[1-2]，是具有開發(fā)潛力的重要苜蓿種質(zhì)資源，可作為改良苜?？剐云焚|(zhì)、創(chuàng)造適宜寒旱環(huán)境種質(zhì)的新遺傳材料[3-9]。目前，國內(nèi)對俄羅斯雜花苜蓿的研究僅限于引種試驗[1-2]，尚未見有關(guān)種質(zhì)應(yīng)用方面的研究報道。本研究擬建立一個操作簡便、可重復(fù)性強且周期短效率高的俄羅斯雜花苜蓿再生體系，研究不同激素種類及組合對其再生體系的影響，以期為進一步開發(fā)利用其優(yōu)良種質(zhì)資源，進行細(xì)胞雜交及培育新的牧草品種奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料及方法

1.1試驗材料 俄羅斯雜花苜蓿種子由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院提供。

1.2試驗方法

1.2.1愈傷組織的誘導(dǎo) 挑選完整飽滿大小均勻的俄羅斯雜花苜蓿種子，用蒸餾水沖洗浸泡30 min后，以升汞溶液浸泡10 min，再用酒精消毒處理1 min，無菌水洗滌3～5次后，接種在MS培養(yǎng)基上。在25 ℃下培養(yǎng)，光照強度為2 500 lx，光照周期為光照∶黑暗=16 h∶8 h。待5～7 d子葉完全展開而真葉尚未長出時，將其子葉及下胚軸剪切成3～5 mm，分別進行愈傷組織的誘導(dǎo)[10-11]。誘導(dǎo)愈傷所用基本培養(yǎng)基為添加了2.5%蔗糖和0.7%瓊脂的MS培養(yǎng)基，先單獨對不同濃度2,4-D(0.25～3.0 mg·L-1)進行試驗[12]，之后在最佳濃度2,4-D基礎(chǔ)上對6-BA、KT、NAA 3種激素的3個不同水平進行L9(33)正交試驗[13-16]，試驗設(shè)計見表1。

表1 L9(33)正交試驗的因素與水平Table 1 Factors and levels of L9(34) orthogonal test mg·L-1

1.2.2愈傷組織的分化 待外植體在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)30～45 d，挑選質(zhì)地疏松、色澤鮮亮、胚性較好的愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基上進行分化培養(yǎng)，25 d后統(tǒng)計分化率，篩選愈傷組織分化最佳激素組合。

1.2.3生根培養(yǎng)及植株再生 將所得分化幼苗或不定芽(長1～2 cm)轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)，15～20 d后，統(tǒng)計生根率。待大部分幼苗長出4～5條既粗且長的須根后進行煉苗。打開三角瓶的封口膜在室溫條件下放置2 d，用自來水沖掉幼苗根部的培養(yǎng)基，移栽至裝有配方土(蛭石∶營養(yǎng)土∶灰土=1∶1∶1)[17]的小花盆中培養(yǎng)，即可獲得完整的再生植株。

1.2.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析 采用EXCEL和SPSS 16.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析，試驗中每個處理重復(fù)3次。

出愈率=形成愈傷組織的外植體數(shù)/接入外植體總數(shù)×100%；

分化率=形成分化芽的愈傷數(shù)/接入愈傷總數(shù)×100%；

生根率=生根的分化芽個數(shù)/接種分化芽總數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1激素對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.1.12,4-D濃度對愈傷組織誘導(dǎo)的影響 外植體在不同2,4-D濃度培養(yǎng)基上誘導(dǎo)培養(yǎng)3～5 d后均可發(fā)生萌動膨大現(xiàn)象，邊緣處有明顯的增殖細(xì)胞團，7～10 d后有肉眼可見的愈傷組織形成(圖1)。繼代2～3次后愈傷組織逐漸增多。下胚軸普遍出愈快，顏色較淺；子葉出愈慢，顏色較深。

圖1 愈傷組織誘導(dǎo)初期Fig.1 The beginning of callus induction

2,4-D濃度對愈傷組織誘導(dǎo)速度和出愈率起重要作用。隨著2,4-D濃度的增加愈傷組織的誘導(dǎo)率也逐漸增大，E3濃度下子葉和下胚軸的出愈率均達到最高值，分別為90.0%和91.1%，此后出愈率反而隨2,4-D濃度增加而降低;當(dāng)2,4-D濃度上升為E6時，出愈率降至最低，分別為48.9%和54.4%(表2)。其中E3、E4的子葉和下胚軸所形成愈傷組織顏色為淺黃綠或淺綠色，質(zhì)地疏松柔軟，部分表面有突起顆粒，增殖速度較快；其余處理中下胚軸愈傷組織多為稀軟糊狀或表面呈絨毛狀，增殖緩慢，易褐化死亡，子葉所得愈傷組織質(zhì)地松脆易碎或表面呈白毛狀，部分快速增殖后褐化死亡。由于良好的愈傷狀態(tài)對后繼的分化試驗和原生質(zhì)體的分離均有重要影響，因此，認(rèn)為1.0 mg·L-1為誘導(dǎo)俄羅斯雜花苜蓿子葉和下胚軸形成愈傷組織的最佳2,4-D濃度。

根據(jù)愈傷組織的色澤、質(zhì)地及生長快慢將獲得的愈傷組織分為5個類型。Ⅰ：乳白色或淺黃色，質(zhì)地稀軟呈糊狀，增殖速度緩慢，容易褐化死亡；Ⅱ：乳白色或淺黃褐色，質(zhì)地堅密緊實，表面有雪花狀或絨毛狀物質(zhì)，無分化能力，最終死亡；Ⅲ：淺黃綠色，表面為小顆粒突起，增殖較慢，有分化能力；Ⅳ：淺綠色，質(zhì)地柔軟疏松，有致密的綠色內(nèi)核，表面突起，增殖較快，分化能力強，速度快；Ⅴ：黃色或淺綠色，表面有突起的顆粒，質(zhì)地松脆易破碎，增殖迅速，易褐化。

表2 不同2,4-D濃度對子葉和下胚軸愈傷組織出愈率的影響Table 2 Effects of different 2,4-D concentrations on callus

2.1.2不同激素濃度及組合對愈傷組織誘導(dǎo)的影響 本試驗發(fā)現(xiàn)，雖然2,4-D對愈傷組織形成有明顯的作用，但形成愈傷多為乳白色或黃色，組織結(jié)構(gòu)不明顯，分化能力差。因此，在2,4-D濃度為1.0 mg·L-1基礎(chǔ)上對6-BA、KT、NAA 3種激素設(shè)計L9(33)正交試驗。結(jié)果表明，以子葉為外植體時，T4的誘導(dǎo)效果最好，出愈率為91.1%(表3)，愈傷狀態(tài)為Ⅳ級(圖2)。極差比較結(jié)果為A>B>C，因素和(Kimax)表明A2B1C3為最佳激素組合。方差分析結(jié)果顯示(表5)，A因素(6-BA)與子葉愈傷組織誘導(dǎo)間為極顯著相關(guān)(P<0.01)，B、C兩因素(KT、NAA)為顯著相關(guān)(P<0.05)；各因素多重比較結(jié)果表明，A2B1C3為3種激素的最佳組合。綜上分析可得，在MS+E3基礎(chǔ)上1.0 mg·L-16-BA+0 KT+1.0 mg·L-1NAA組合為誘導(dǎo)子葉形成愈傷組織的最佳組合。

表3 子葉愈傷組織誘導(dǎo)正交試驗設(shè)計表及結(jié)果Table 3 Results of orthogonal test for cotyledon callus induction

表4 下胚軸愈傷組織誘導(dǎo)正交試驗設(shè)計表及結(jié)果Table 4 Results of orthogonal test for Hypocotyl callus induction

以下胚軸為外植體時，T2的誘導(dǎo)效果最好，出愈率為93.3%(表4)，愈傷狀態(tài)為Ⅳ級(圖2)。極差比較結(jié)果為A>B>C，因素和Kimax表明，A1B2C1為最佳激素組合。方差分析結(jié)果顯示，A、B兩因素(6-BA、KT)與下胚軸愈傷組織誘導(dǎo)間為極顯著相關(guān)(P<0.01)，C因素(NAA)為顯著相關(guān)(P<0.05)，且6-BA效果最為顯著，KT、NAA次之；各因素多重比較結(jié)果表明，A1B2C1為3種激素的最佳組合。綜上分析，在MS+E3基礎(chǔ)上0.5 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1KT+0 mg·L-1NAA為誘導(dǎo)下胚軸形成愈傷組織的最佳組合。

表5 方差分析及多重比較Table 5 Variance analysis and multiple comparison

2.2愈傷組織的分化 通過以上試驗獲得大量質(zhì)地松軟、色澤鮮綠且組織結(jié)構(gòu)明顯的愈傷組織后，將其轉(zhuǎn)移到以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并添加不同濃度KT和NAA的分化培養(yǎng)基中(表6)。結(jié)果顯示，8種分化培養(yǎng)基中子葉愈傷組織的分化率均高于下胚軸愈傷組織。其中,M6培養(yǎng)基的子葉愈傷組織與下胚軸愈傷組織分化率最高，分別為91.1%和83.3%，多重比較顯示,M6與其它7個處理結(jié)果存在顯著差異，且所形成的分化芽顏色鮮綠茁壯，說明M6為俄羅斯雜花苜蓿愈傷組織分化的最佳配比。愈傷組織經(jīng)M6培養(yǎng)10～14 d后出現(xiàn)綠色芽點，20 d左右形成分化芽(圖3)，30 d左右可分化出葉片形成分幼苗(圖3)。試驗還發(fā)現(xiàn)，少數(shù)分化苗在形成過程中還伴有幼根形成。因此，使俄羅斯雜花苜蓿體細(xì)胞胚發(fā)生分化和形成分化芽效果顯著的培養(yǎng)基是MS+0.5 mg·L-1KT+0.3 mg·L-1NAA。

圖2 Ⅵ級愈傷組織Fig.2 Ⅵ callus

圖3 分化芽和分化苗 Fig.3 Differentiated buds and seedlings

表6 不同激素組合對愈傷組織分化的影響Table 6 Effects of different phytohormone conbitions on embryogenic callus induction

2.3生根培養(yǎng)及再生植株的獲得 將上述所得分化苗轉(zhuǎn)移至裝有生根培養(yǎng)基的三角瓶，培養(yǎng)生根。G6生根率最高，可達96.7%，生根速度快，根健壯粗長(表7)。多重比較顯示，G6與其它處理生根率存有顯著差異。說明生長素IBA比NAA更有利于生根，且低糖低無機鹽的1/2 MS培養(yǎng)基較MS培養(yǎng)基的生根效果顯著。分化苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基培養(yǎng)10～15 d可見根狀突起形成，25～30 d后可形成正常根(圖4)。當(dāng)有3條以上長5 cm的粗壯根形成時即可煉苗移栽至花盆中，使其生長成完整的植株。

3 討論

3.1利用正交設(shè)計法篩選最佳誘導(dǎo)愈傷組織的激素組合 植物愈傷組織誘導(dǎo)過程中植物生長調(diào)節(jié)物的種類及濃度的配比十分關(guān)鍵[18]，為了誘導(dǎo)出質(zhì)地及狀態(tài)良好的愈傷組織，必須摸索適宜的激素組合。目前，在苜蓿愈傷組織誘導(dǎo)試驗中多采用隨機試驗設(shè)計對植物生長激素種類及濃度進行配比研究，但此方法耗時費力且誤差較大，故本研究對3種激素的3個水平進行L9(33)正交試驗，通過對9種試驗處理結(jié)果的數(shù)據(jù)分析，準(zhǔn)確地綜合評價各激素的影響力，優(yōu)化篩選誘導(dǎo)俄羅斯雜花苜蓿愈傷組織的最佳激素組合，提高試驗效率。

表7 不同培養(yǎng)基和激素濃度對生根率的影響Table 7 Effects of different medium and phytohormone on footing rate

圖4 再生根系和再生植株 Fig.4 Regenerated roots and plants

3.2激素對愈傷組織誘導(dǎo)的影響 植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對愈傷組織的誘導(dǎo)具有重要作用，分為植物細(xì)胞生長素和植物細(xì)胞分裂素兩類[18-20]，豆科牧草組培試驗中常采用的生長素有2,4-D、NAA、IBA，細(xì)胞分裂素有KT、6-BA、ZT等[21]。其中2,4-D是誘導(dǎo)愈傷組織時使用最多、作用明顯的重要激素[22-23]，但不是唯一激素，即2,4-D與其它激素組合和單獨使用相比能更有效地形成良好的組織結(jié)構(gòu)、質(zhì)地及顏色。但在分化試驗中隨著2,4-D濃度增加，體細(xì)胞胚的分化能力明顯下降[21]，即2,4-D不適用于愈傷組織的誘導(dǎo)分化試驗。本研究表明，適宜誘導(dǎo)俄羅斯雜花苜蓿子葉和下胚軸愈傷組織的2,4-D濃度為1.0 mg·L-1，這一結(jié)果與王姝杰等[17]的結(jié)論不同，說明不同苜蓿品種對2,4-D濃度的敏感性不同。在此基礎(chǔ)上本試驗又兼顧兩類植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對6-BA、KT、NAA 3種激素進行愈傷組織誘導(dǎo)的正交試驗，分析評價各激素的影響程度，綜合優(yōu)化了激素組合。試驗發(fā)現(xiàn)，6-BA對俄羅斯雜花苜蓿愈傷組織誘導(dǎo)作用最高，KT和NAA次之，這與蔡文燕等[13]在紫花苜蓿(Medicagosativa)愈傷組織誘導(dǎo)研究中的結(jié)果相似。并且本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)KT濃度增大到1.0 mg·L-1時，易導(dǎo)致愈傷組織分裂增殖速度過快而瘋長致死。

3.3激素對愈傷組織分化及再生的影響 本研究在分化試驗中發(fā)現(xiàn)低濃度的KT、NAA對愈傷組織分化不定芽起到重要作用，當(dāng)NAA濃度大于0.5 mg·L-1時，對愈傷組織的分化產(chǎn)生抑制作用。這與王娟等[12]在隴東野生紫花苜蓿研究中的結(jié)果一致。在使苜蓿分化苗生根培養(yǎng)的研究中常使用MS或1/2MS培養(yǎng)基[4,11]，并添加不同濃度的NAA作為生根激素[12,17]，本研究除設(shè)不同濃度NAA外，還采用了不同濃度IBA，分別對二者在生根作用中的影響進行比較。試驗發(fā)現(xiàn)，IBA的生根作用顯著高于NAA，生根率最高可達96.67%，且再生成的根系健壯粗長，可見IBA比NAA更有利于俄羅斯雜花苜蓿愈傷組織分化苗再生根形成。

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