鄭 咪，楊寅桂，曾勇軍，周慶紅

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院 作物生理生態(tài)與遺傳育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330045)

夏天無(Corydalisdecumbens)又名一粒金丹，落水珠，為罌粟科紫堇屬伏生紫堇多年生草本植物[1]。在我國主要分布于江西、湖南、福建、浙江、安徽和江蘇等省(區(qū))，適宜在氣候溫暖潮濕、土層深厚的沙質(zhì)土壤地區(qū)生長[2]。夏天無為傳統(tǒng)中藥材，其塊莖中含有多種具有活性成分的生物堿，具通絡(luò)活血祛瘀、行氣止痛解痙等功效[3-5]。近年來，以夏天無有效成分為主的制劑有夏天無片、夏天無注射液、夏天無眼藥水等，在防治腦梗死、周圍神經(jīng)損害性癱瘓、腰椎間盤突出癥、坐骨神經(jīng)痛、關(guān)節(jié)腰腿等疼痛及中小學(xué)生假性近視中有較好療效[6-7]。近年來，為滿足藥材市場需求，野生夏天無被過度采挖，導(dǎo)致其資源日漸減少。為了解決夏天無的供需矛盾和保護(hù)野生資源，江西省余江、樟樹等地正在嘗試進(jìn)行人工栽培。其栽培時間為10月中下旬到次年4月中旬，生產(chǎn)中與水稻(Oryzasativa)輪作，是冬閑經(jīng)濟(jì)作物。這對于保護(hù)夏天無野生資源、供應(yīng)藥材市場需求、增加農(nóng)民收入具有重要意義。但夏天無以地下塊莖為繁殖器官，留種時間為4月中下旬至10月中下旬，期間歷經(jīng)夏季高溫，種莖易腐爛難保存，據(jù)我們前期調(diào)查統(tǒng)計(jì)，夏天無塊莖貯藏期爛種率達(dá)到40%～60%，大大增加了留種量；而且大多數(shù)留種塊莖表面帶菌，造成夏天無品質(zhì)退化，產(chǎn)量下降等問題。人工種植另一問題是塊莖用種量較大，每畝平均用種量為35 kg，約為最終產(chǎn)量的1/8。植物離體快繁技術(shù)日趨成熟，而且再生植株能夠較好地保持物種本身的生物特性和遺傳特性。因此，針對目前夏天無生產(chǎn)種源不足、品質(zhì)下降等現(xiàn)實(shí)問題，采用植物組培技術(shù)對夏天無進(jìn)行試管苗誘導(dǎo)，以解決夏天無生產(chǎn)的實(shí)際需求，對夏天無種質(zhì)資源保存和生產(chǎn)意義重大。

近年來，利用組織培養(yǎng)技術(shù)對植物試管苗誘導(dǎo)的研究已有大量報道，但有關(guān)夏天無及其同屬植物組織培養(yǎng)方面的研究報道尚不多見。謝賽萍[8]以地下塊莖和葉片為外植體對大葉元胡(Corydalisyanhusuo)的愈傷組織和試管塊莖誘導(dǎo)進(jìn)行了研究，并獲得了大葉元胡試管塊莖誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件；Noboru等[9]以切成薄片的延胡索(C.ambigua)塊莖為外植體進(jìn)行了組培快繁研究，并通過激素誘導(dǎo)獲得了愈傷組織和再生植株，并對其再生植株的遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行了分析。本研究分析不同培養(yǎng)溫度、激素濃度、芽切取部位對夏天無塊莖出芽、芽增殖及試管苗生根情況的影響，確定夏天無試管苗誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)條件，以期為夏天無離體快繁和再生體系的建立提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料 以江西省余江縣人工種植的夏天無塊莖(兩年生，塊莖平均直徑為1.16 cm)為試驗(yàn)材料。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1外植體的消毒 選取大小一致的夏天無塊莖，流水沖洗1 h后置于超凈工作臺上消毒。具體做法是無菌蒸餾水沖洗1次，75%酒精浸泡30 s，無菌蒸餾水再沖洗3次， 0.1% HgCl2溶液浸泡20 min[10]，最后用無菌水沖洗5次后備用。

1.2.2塊莖出芽誘導(dǎo) 以1/2 MS為基本培養(yǎng)基(附加蔗糖30 g·L-1、瓊脂7.5 g·L-1，pH 5.8)，將已消毒塊莖分別接入附加不同濃度6-BA、NAA的培養(yǎng)基中(表1)，篩選6-BA和NAA的最佳濃度配比；在此基礎(chǔ)上，分別添加0.5、1.0和2.0 mg·L-1的GA3，并對GA3的濃度進(jìn)行選擇。將接入塊莖的培養(yǎng)基分別放入16、20及24 ℃的人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，誘導(dǎo)塊莖出芽，光照時間14 h·d-1，光照強(qiáng)度2 500 lx，每個處理接種8瓶，每瓶接種8個塊莖。15 d后觀察記載塊莖出芽數(shù)及芽生長情況。

表1 夏天無塊莖出芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方Table 1 Formulations of buds induction for the tuber of Corydalis decumbens mg·L-1

1.2.3芽增殖誘導(dǎo) 以兩種方式切取塊莖上的芽，一種是只切取單芽，另一種是芽和其基部的塊莖表皮一同切取。切取后分別接入到附加不同濃度的6-BA(1.5、2.5、3.5和4.5 mg·L-1)，0.1 mg·L-1NAA ，0.5 mg·L-1GA3的培養(yǎng)基中，置于人工氣候箱中培養(yǎng)，光照時間14 h·d-1，光照強(qiáng)度2 000 lx，培養(yǎng)溫度為16 ℃(前期篩選)，每個處理接10瓶，每瓶接種4個芽。每天觀察芽的長勢及增殖情況，20 d后統(tǒng)計(jì)芽增殖數(shù)。

1.2.4試管苗誘導(dǎo) 從培養(yǎng)基中將增殖芽取出，分切成單芽，然后將單個芽接入附加不同濃度6-BA、NAA和GA3的培養(yǎng)基中(表2)，每個處理接種8瓶，每瓶接種4個芽，最后置于光照時間10 h·d-1，光照強(qiáng)度1 500 lx， 培養(yǎng)溫度為16 ℃的人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。30 d后觀察芽的成苗數(shù)、試管苗生長及生根狀況。

表2 夏天無試管苗誘導(dǎo)配方Table 2 Formulations of test-tuber plantlets of Corydalis decumbens mg·L-1

1.2.5統(tǒng)計(jì)分析

增殖率=(增殖芽總數(shù)/接種芽總數(shù))×100%；

出芽率=(發(fā)芽總數(shù)/接種總塊莖數(shù))×100%。

芽增殖率的每組數(shù)據(jù)以平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差(SD)表示。數(shù)據(jù)采用DPS軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1不同溫度對誘導(dǎo)塊莖出芽的影響 培養(yǎng)溫度對夏天無塊莖出芽影響較大(圖1)，3種溫度下，誘導(dǎo)塊莖出芽數(shù)存在顯著差異(P<0.05)(表3)。16 ℃下，夏天無出芽最早，塊莖平均出芽數(shù)最多，為3.63，芽健壯，淺紫色，后期芽長勢快；20 ℃下可以誘導(dǎo)夏天無塊莖出芽，但塊莖平均出芽數(shù)極低，為1.37，芽瘦小，白色，芽后期長勢不理想。而當(dāng)溫度達(dá)到24 ℃時，夏天無塊莖不出芽。由此可見，誘導(dǎo)夏天無塊莖出芽較適宜的溫度為16 ℃。

圖1 夏天無試管苗誘導(dǎo)Fig.1 Induction of test-tube plantlets in Corydalis decumbens

表3 不同溫度對塊莖出芽誘導(dǎo)的影響Table 3 Effects of different temperatures on the buds induction of the tuber of Corydalis decumbens

表4 不同濃度6-BA、NAA對塊莖誘導(dǎo)出芽的比較Table 4 Comparison of the bud induction from the tuber of Corydalis decumbens with different concentration of 6-BA、NAA

2.2不同濃度6-BA和NAA對塊莖誘導(dǎo)出芽的影響 將夏天無塊莖分別接種到12種不同6-BA和NAA激素組合的培養(yǎng)基上進(jìn)行出芽誘導(dǎo)，結(jié)果表明(表4)，夏天無塊莖在添加有不同濃度6-BA和NAA培養(yǎng)基上培養(yǎng)時，其出芽時間、出芽數(shù)和芽生長勢均存在顯著差異(P<0.05)。在4種6-BA濃度中，誘導(dǎo)出芽效果最好的為2.5 mg·L-1，而高濃度的NAA會抑制芽的生長；在3種NAA濃度中，以0.1 mg·L-1NAA對芽的生長最為有利；在12種激素組合中，以A4培養(yǎng)基(2.5 mg·L-16-BA，0.1 mg·L-1NAA)誘導(dǎo)塊莖出芽效果最佳，塊莖出芽時間也最早，接種19 d后即有芽出現(xiàn)，并且平均出芽數(shù)最高，為3.84，芽健壯，呈紫色。

在1/2 MS+2.5 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA培養(yǎng)基上添加GA3后，誘導(dǎo)塊莖出芽時間都不同程度地縮短，芽生長更為健壯(表5)，說明GA3確實(shí)有打破塊莖休眠和促進(jìn)芽生長的作用。但不同GA3濃度對誘導(dǎo)塊莖出芽數(shù)存在極顯著差異 (P<0.05)。在添加了0.5 mg·L-1GA3的培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)夏天無塊莖出芽最快(12 d)，塊莖平均出芽數(shù)最多，為3.87，且芽生長健壯。而當(dāng)GA3濃度增加時，塊莖平均出芽數(shù)減少，同時出芽時間延長。由此可見，高濃度的GA3對誘導(dǎo)塊莖出芽具有抑制作用，在1/2 MS+2.5 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA培養(yǎng)基上加入0.5 mg·L-1GA3有利于塊莖誘導(dǎo)出芽。

2.3不同濃度6-BA對夏天無芽增殖的影響 將夏天無塊莖上誘導(dǎo)出的芽接入含不同濃度6-BA的培養(yǎng)基中，7 d后芽周圍均出現(xiàn)少量白色愈傷組織，到15 d左右，外植體周圍慢慢出現(xiàn)叢生芽，30 d后，芽不再增殖。當(dāng)6-BA的濃度為3.5 mg·L-1時，增殖芽數(shù)最多，平均單芽增殖率為3.65，顯著高于其它濃度培養(yǎng)基的誘導(dǎo)效果，且增殖芽生長健壯，長勢較好；當(dāng)6-BA的濃度為1.5 mg·L-1時，平均單芽增殖率為2.90，后期增殖芽生長緩慢，芽瘦小。而當(dāng)6-BA濃度達(dá)到4.5 mg·L-1時，平均單芽增殖率為3.35(表6)。由此可見，當(dāng)6-BA的濃度為3.5 mg·L-1時，有利于誘導(dǎo)芽的出現(xiàn)和增殖。

2.4不同切取部位對夏天無芽增殖的影響 將塊莖誘導(dǎo)出的芽以兩種方式切取，即僅切取單芽和芽連同芽基部塊莖表皮一同切取，將切下的芽接入1/2 MS+3.5 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA培養(yǎng)基上，5 d后觀察發(fā)現(xiàn)(表7)，兩種切取方法對夏天無增殖芽的誘導(dǎo)數(shù)存在顯著差異。以連同塊莖表皮一起切下的芽基部芽眼長出叢生芽后,基部切口處產(chǎn)生少量愈傷組織，不久愈傷組織分化成芽，單芽平均增殖數(shù)為3.71；而切取的單芽接種于同樣培養(yǎng)基后，芽基部則不會出現(xiàn)叢生芽，但不久會在芽基部切口處產(chǎn)生大量愈傷組織，并很快分化成芽，單芽平均增殖數(shù)為3.43；由此看來，帶塊莖表皮芽的增殖總數(shù)高于不帶塊莖表皮的芽，且后期叢生芽長勢健壯。

2.5不同激素對試管苗形成的影響 將繼代增殖的芽切成單個芽接入附加不同濃度NAA的培養(yǎng)基中，20 d后觀察試管苗的生長狀況，在沒有添加6-BA、NAA的培養(yǎng)基上，試管苗生長健壯，并產(chǎn)生大量不定根，后期試管苗生長快(表8)。在添加低濃度6-BA(0.1 mg·L-1)的培養(yǎng)基上，夏天無幼苗長勢差，葉不能正常伸展，生成不定根的數(shù)量隨NAA濃度的增加而減少；當(dāng)6-BA濃度增加至0.5 mg·L-1時，夏天無幼苗長勢更弱，葉不伸展，且不能形成不定根，后期試管苗基部出現(xiàn)少量愈傷組織，直至幼苗褐化死亡。在只添加NAA的培養(yǎng)基上，低濃度的NAA可誘導(dǎo)少量不定根的產(chǎn)生，但因?yàn)椴欢ǜ鶖?shù)量少，后期試管苗葉片生長緩慢，最后出現(xiàn)黃化、枯死等現(xiàn)象；高濃度的NAA則抑制不定根的形成。由此可見，試管苗形成和生根以未添加任何激素的1/2 MS基本培養(yǎng)基最佳。

表5 不同濃度GA3對塊莖誘導(dǎo)出芽的影響Table 5 Effects of different concentrations of GA3 on the buds induction for the tuber of Corydalis decumbens

表6 不同濃度6-BA對芽增殖的影響Table 6 Effects of different 6-BA concentrations on buds proliferation of Corydalis decumbens

表7 不同切取部位對夏天無芽增殖影響Table 7 Effects of different cutting sites on buds proliferation of Corydalis decumbens

表8 不同激素對試管苗生根及生長的影響Table 8 Effects different hormones on plantlets rooting and growth of Corydalis decumbens

3 討論與小結(jié)

3.1溫度對夏天無試管苗誘導(dǎo)的影響 溫度是影響植物生長發(fā)育的重要因素，也是植物組織培養(yǎng)中不可忽視的條件。植物組織培養(yǎng)的溫度一般為25 ℃左右，但也有些植物離體培養(yǎng)需要較低或較高溫度條件，研究表明，適當(dāng)降低培養(yǎng)溫度(15 ℃)可以有效降低香石竹(Dianthuscaryophyllus)玻璃苗的比例，提高苗的健壯程度及移栽成活率[11]；適宜的低溫有利于黃芪(Astragalusmembranaceus)短枝的生長，以20 ℃培養(yǎng)效果最好[12]； 25 ℃最適合鐵皮石斛(Demdrobiumcardidum)原球莖的生長繁殖，而較低的溫度(23 ℃)有利于減少分生苗的數(shù)量，形成健壯高大的試管苗[13]。王碧琴等[14]對木蘭科7種植物的組織培養(yǎng)技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，外植體分化的最適溫度在20～23 ℃，過高過低都不利于產(chǎn)生不定芽。本研究中，在24、20和16 ℃3種溫度下對夏天無試管苗進(jìn)行誘導(dǎo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)16 ℃是誘導(dǎo)夏天無塊莖出芽、芽增殖以及試管苗生長的最適溫度，原因可能是夏天無塊莖在較高溫度下處于休眠狀態(tài)，低溫有利于打破其休眠，誘導(dǎo)出芽。夏天無植株在冬季生長，適應(yīng)了冷涼的氣候，因此，在離體培養(yǎng)狀態(tài)下也適宜在較低溫度下生長，20 ℃以上的培養(yǎng)溫度會抑制其生長。

3.2激素對夏天無試管苗誘導(dǎo)的影響 激素在植物組織培養(yǎng)過程中起著重要作用[15]。一般誘導(dǎo)不定芽的形成時細(xì)胞分裂素高于生長素的用量，而誘導(dǎo)不定根發(fā)生只用生長素或配合使用較低濃度的細(xì)胞分裂素[16]。在培養(yǎng)基MS+1.5 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA上，鈍葉瓦松(Orostachysmalacophyllus)腋芽增殖效果最好，增殖倍數(shù)為5.35，苗的長勢也較好；而最佳的生根培養(yǎng)基為1/2 MS+0.3 mg·L-1NAA，生根率達(dá)96.67%[17]。脫毒快繁研究菊薯(Smallanthussonchifolius)莖段增殖的最適培養(yǎng)基為MS+1.0 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA，最適生根培養(yǎng)基為1/2 MS+0.01 mg·L-1NAA[18]。本研究表明，在培養(yǎng)基上添加適宜濃度的6-BA和NAA時，夏天無塊莖能夠較快出芽，常規(guī)繁殖的夏天無塊莖往往只有1～2個芽萌發(fā)，而激素誘導(dǎo)下的塊莖則顯示出較強(qiáng)的萌芽力，萌芽數(shù)多在3～4個，特別是在添加GA3(0.5 mg·L-1) 的培養(yǎng)基中，夏天無塊莖出芽更快，且誘導(dǎo)出的芽更健壯。本試驗(yàn)結(jié)果與董少鵬和柏峰[19]研究GA3對玫瑰(Rosarugosa)莖芽誘導(dǎo)的結(jié)論一致。

激素濃度也是影響芽增殖的重要因素，一定濃度的6-BA對打破蝴蝶蘭(Phalaenopsisamabilis)腋芽的休眠具有重要作用[20]，6-BA對大蒜(Alliumsativum)芽的增殖具有明顯效果[21]，6-BA在1.26～1.99 mg·L-1的范圍時最有利于何首烏(Polygonummultiflorum)不定芽的增殖[22]。本研究在芽增殖的培養(yǎng)基中添加6-BA、NAA和GA3可以有效誘導(dǎo)芽的增殖，篩選到的夏天無芽增殖的最佳培養(yǎng)基為1/2 MS+3.5 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA+0.5 mg·L-1GA3，且叢生芽生長健壯。

不定根的形成是組織培養(yǎng)過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，它直接影響試管苗的長勢和后期移栽成活率的高低，關(guān)系到組織培養(yǎng)成敗。1/2 MS培養(yǎng)基附加0.5 mg·L-1IBA 是喜樹(Camptothecaacuminata)組培苗的最佳生根培養(yǎng)基[23]；六棱景天(Sedumsexangulare)的最佳生根培養(yǎng)基為1/4 MS+0.05 mg·L-1NAA+0.01 mg·L-1IBA[24]；誘導(dǎo)蝴蝶蘭生根的最佳培養(yǎng)基為 1/2 MS+0.1 mg·L-1NAA ，誘導(dǎo)的生根率為98%[25]；毛脈酸模(Rumexgmelini)最佳生根培養(yǎng)基為無激素的MS培養(yǎng)基，生根率可達(dá)92%[26]。本研究也表明，不添加NAA或是低濃度的NAA對夏天無試管苗不定根的形成更有利。

另外，本研究將塊莖誘導(dǎo)出的芽以兩種方式切取，結(jié)果表明，切取的帶塊莖表皮芽的增殖總數(shù)高于不帶塊莖表皮的芽增殖總數(shù)，且后期叢生芽長勢健壯。這可能有兩個原因，一是帶塊莖表皮的芽基部潛伏芽在外源激素的刺激下，加上培養(yǎng)基充足的營養(yǎng)，使這部分芽能夠得以萌發(fā)并且生長良好。另外切口處在外源激素的誘導(dǎo)下能夠產(chǎn)生愈傷組織并分化成芽，因此帶塊莖表皮芽的增殖效果好于不帶塊莖表皮的芽。

本研究以夏天無休眠塊莖為外植體，首次成功建立了夏天無組織培養(yǎng)再生體系，為夏天無微塊莖繁殖和組培苗的移栽，大面積的人工栽培及其工廠化生產(chǎn)提供了一定的理論基礎(chǔ)與科學(xué)依據(jù)，為夏天無種質(zhì)資源保存和可持續(xù)開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。

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