鄢國(guó)平，鄒頭君，邵春桃，李 貞，常秀鵬

（武漢工程大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，湖北 武漢 430074；武漢工程大學(xué)綠色化工過(guò)程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430074）

0 引 言

在臨床醫(yī)學(xué)診斷中，腫瘤的及時(shí)、準(zhǔn)確的發(fā)現(xiàn)對(duì)治療起著至關(guān)重要的作用［1－2］．磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）技術(shù)是當(dāng)前用于腫瘤檢測(cè)與診斷的先進(jìn)影像技術(shù)之一．磁共振成像造影劑（MRI contrast agent）能縮短體內(nèi)局部組織中水質(zhì)子的弛豫時(shí)間，提高成像對(duì)比度和清晰度［3］，可有效地區(qū)分病變組織與正常組織的差異，有利于進(jìn)行疾病的早期診斷，這樣不僅能夠及時(shí)準(zhǔn)確的對(duì)癥下藥，進(jìn)行早期治療，而且還能在很大程度上提高治療效果，提高患者的治愈率和存活率．

二乙三胺五乙酸釓（Gd－DTPA）是目前臨床上應(yīng)用最廣泛的MRI造影劑，在體內(nèi)主要循環(huán)于組織細(xì)胞外液間，沒(méi)有特定的生理分布，因此Gd－DTPA在體內(nèi)分布沒(méi)有生物學(xué)專(zhuān)一性（靶向性）．另外，由于Gd－DTPA是以鈉鹽或葡甲胺鹽的形式應(yīng)用于臨床，為離子型造影劑，故有滲透壓偏高的問(wèn)題，這些高濃度的釓類(lèi)對(duì)比劑還不可避免地產(chǎn)生諸如腎系統(tǒng)纖維化（NSF）等毒性反應(yīng)［4－5］．因此，在造影劑的基本骨架上引入各種靶向基團(tuán)進(jìn)行化學(xué)修飾，制備得到非離子型配合物，不僅可賦予造影劑組織或器官的靶向性，而且可降低造影劑的滲透壓、毒副作用［6－8］．卟啉及其金屬配合物對(duì)腫瘤具有特異的親和性，注射入人體后會(huì)在腫瘤組織富集，因此卟啉化合物可用作為造影劑的腫瘤靶向基團(tuán)［9－14］．

本研究用5－（4－氨基苯基）－10，15，20－三吡啶基卟啉對(duì)DTPA基本骨架進(jìn)行化學(xué)修飾，合成一種小分子配體二乙三胺三乙酸二酰（5－（4－氨基苯基 ）－10，15，20－三 吡 啶 基 卟 啉 ）（DTPA－2APTMPyP），再與金屬釓離子Gd（Ⅲ）配合，從而制備小分子造影劑二乙三胺三乙酸二酰（5－（4－氨基苯基）－10，15，20－三吡啶基卟啉）釓配合物（Gd－DTPA－2APTMPyP），其具體合成路線如圖1．并對(duì)所合成的配體及其配合物進(jìn)行了FT－IR、UV、1 H NMR等結(jié)構(gòu)表征，進(jìn)一步研究了造影劑的體外弛豫性能與細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)．

圖1 腫瘤靶向造影劑（Gd－DTPA－2APTMPyP）的合成路線Fig．1 Synthetic route of tumor－targeting MRI contrast agent（Gd－DTPA－2APTMPyP）

1 實(shí)驗(yàn)部分

1．1 試劑及儀器

二乙三胺五乙酸（DTPA）、4－硝基苯甲醛、4－吡啶甲醛、乙酸酐、氧化釓、濃鹽酸、碘甲烷、無(wú)水乙醇、無(wú)水甲醇、無(wú)水乙醚、丙酸、三氯甲烷、二氯甲烷均為分析純?cè)噭?；N，N－二甲基甲酰胺（DMF）用Ca H2干燥48 h后蒸餾備用．吡咯、吡啶用前蒸餾．

1H NMR用Varian Mercury VX－300型核磁共振波譜儀于300 MHz下測(cè)定；FT－IR用Nicolet Imapct 420型傅里葉紅外分析儀測(cè)定，KBr壓片；UV用 UNIC－2802 H UV／Vis Spectrophotometer紫外光譜測(cè)定；熔點(diǎn)用北京光電科學(xué)儀器廠XT4－100x顯微熔點(diǎn)儀（數(shù)字顯示，溫度校正）測(cè)定；自旋－晶格弛豫時(shí)間（T 1）用 Varian Mercury－Vx300 NMR（300 MHz）核磁共振測(cè)定．

1．2 配體及配合物的合成

1．2．1 配體 DTPA－2APTPyP 二乙三胺五乙酸雙酸酐（DTPAA）參照文獻(xiàn)［15－16］方法制備，5－（4－氨基苯基）－10，15，20－三吡啶基卟啉參照文獻(xiàn)［17］方法制備．將0．8 g 5－（4－氨基苯基）－10，15，20－三吡啶基卟啉（1．28 mmol）加入到盛有20 m L DMF的燒瓶中，在冰浴磁力攪拌的條件下，緩慢加入0．20 g DTPA 雙酸酐（0．64 mmol），低溫反應(yīng)8 h后，室溫下繼續(xù)反應(yīng)24 h．用無(wú)水乙醚沉淀，過(guò)濾干燥，收集固體．再用DMF－無(wú)水乙醚重沉淀，真空干 燥，即 得 配 體 DTPA－2APTPyP 0．64 g，產(chǎn)率：81%．

1．2．2 釓配合物 Gd－DTPA－2APTMPyP的制備

將0．6 g DTPA－2APTPyP（0．36 mmol）溶于20 m L DMF中，攪拌緩慢加入0．16 g CH3I（1．08 m L），40℃下反應(yīng)4 h．加入200 m L無(wú)水乙醚，產(chǎn)生紅褐色沉淀．過(guò)濾，再用DMF－無(wú)水乙醚進(jìn)行重沉淀，真空干燥，即得配體 DTPA－2APTMPyP 0．44g，產(chǎn)率74%．

將0．3 g配體DTPA－2APTMPyP（0．14 mmol）溶于8 m L甲醇中，攪拌緩慢加入0．045 g GdCl3·6 H2O（0．14 mmol），室溫下反應(yīng)2 h．用甲醇－無(wú)水乙醚重沉淀，過(guò)濾，乙醚洗滌，干燥，得到深褐色固體，即金屬配合物 Gd－DTPA－2APTMPyP 0．255 g，產(chǎn)率85%．

1．3 釓配合物弛豫時(shí)間的測(cè)定

將釓配合物 Gd－DTPA－2APTMPyP 溶于二次蒸餾水中，配成濃度為0．1、0．3、0．5、0．7、0．9、1．1 mmol／L的溶液；同樣上述方法，配制濃度為0．15 mmol／L的 Gd－DTPA溶液．調(diào)節(jié)至p H 7～8，以返轉(zhuǎn)回復(fù)法在Varian Mercury－VX300 NMR（300 MHz）核磁共振儀上測(cè)定溶液中質(zhì)子的自旋－晶格弛豫時(shí)間T1，并計(jì)算弛豫率．

1．4 釓配合物體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

用培養(yǎng)液調(diào)節(jié)He La細(xì)胞濃度為60 000～80 000個(gè)／毫升，取96孔培養(yǎng)板加樣，每孔100μL（6 000～8 000個(gè)／孔），在37℃，體積分?jǐn)?shù)5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h．待HeLa細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)孔底之后去掉培養(yǎng)液，加入含不同濃度的小分子釓配合物（Gd－DTPA－2APTMPyP 或者 Gd－DTPA）的新鮮培養(yǎng)液，對(duì)照組則加入不含釓配合物的新鮮培養(yǎng)液．繼續(xù)培養(yǎng)48 h．用培養(yǎng)液洗滌一次，加入100μL的培養(yǎng)液、四甲基偶氮唑鹽（MTT）溶液（5．0 mg／m L，20μL／孔），繼續(xù)培養(yǎng)4 h．棄去上清液，以3%小牛血清－磷酸緩沖鹽水洗二次，傾干液體，加入100μL二甲基亞砜（DMSO），搖勻，室溫放置30min．以無(wú)細(xì)胞空白孔為零點(diǎn)，選取5個(gè)平行樣，測(cè)量OD570值，計(jì)算細(xì)胞相對(duì)存活率．

2 結(jié)果與討論

2．1 紅外表征

配體和配合物的紅外光譜圖如Fig．1，配體DTPA－2APTMPy P在3 436 cm－1為υN－H和υO(shè)H的疊加，1 653 cm－1和1 624 cm－1為酰胺鍵和羧酸根中的υC＝O；配合物Gd－DTPA－2APTMPyP在1 653 cm－1和1 624 cm－1消失，藍(lán)移至1 593 cm－1，說(shuō)明配體在形成配合物后羧酸根和酰胺鍵中的羰基與金屬離子發(fā)生了配位作用．

圖2 DTPA－2APTMPyP和 Gd－DTPA－2APTMPyP的紅外光譜圖Fig．2 FT－IR spectra of DTPA－2APTMPyP and Gd－DTPA－2APTMPyP

2．2 紫外表征

配體和配合物的紫外光譜圖如圖3、4．在紫外可見(jiàn)光譜中，卟啉化合物特殊的化學(xué)結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)在Soret帶有一個(gè)很強(qiáng)的吸收峰；在可見(jiàn)光區(qū)存在4個(gè)較弱的Q吸收帶．

由圖3可知配體DTPA－2APTMPyP的紫外吸收峰為λmax：427，515，558，590，654 nm；由Fig．4可知配合物Gd－DTPA－2APTMPyP的紫外吸收峰為λmax：419，510，549，587，644 nm．對(duì)比可得：配合物的Q帶吸收峰存在一定程度的藍(lán)移，這是由于配體與Gd配合，溶液的極性增強(qiáng)造成的．

圖3 DTPA－2APTMPyP的紫外圖譜Fig．3 UV－Vis spectrum of DTPA－2APTMPyP

圖4 Gd－DTPA－2APTMPyP的紫外圖譜Fig．4 UV－Vis spectrum of Gd－DTPA－2APTMPyP

2．3 核磁共振表征

配體DTPA－2APTPyP的核磁圖譜（圖5）的吸收峰（化學(xué)位移）和各自歸屬為：1 H NMR（d6－DMSO，δ，ppm）：9．49（d，6 H，meta－pyridine），9．21（d，2 H，β－pyrrole），9．13（d，4 H，β－pyrrole），9．00（d，2H，β－pyrrole），8．48（s，1 H，amino），8．43（m，2 H，aminophenyl），8．15（m，6 H，orthophenyl），4．71（m，6 H，NCH3），3．10（s，4 H，2×CH2—COOH），2．97（m，4H，2×CH2—CO—NH），2．90（t，4 H，2×N—CH2），2．73（s，2 H，CH2COOH），2．67（t，4 H，2×N—CH2）．

圖5 DTPA－2APTPyP的核磁圖譜Fig．5 1 H NMR spectrum of DTPA－2APTPyP

2．4 釓配合物對(duì)水質(zhì)子弛豫性能的影響

順磁性MRI造影劑通過(guò)增強(qiáng)水質(zhì)子的弛豫效率從而提高磁共振成像的效果，本實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)為增強(qiáng)其對(duì)溶劑中水質(zhì)子的弛豫速率，用自旋－晶格弛豫率R1表示提高磁共振成像的效果，由下式表示：

上式中（1／T1）obsd和（1／T1）d分別為有順磁性物質(zhì)存在時(shí)觀察到水質(zhì)子的縱向弛豫速率及作為空白樣的純水中質(zhì)子的弛豫速率．R1溶液中順磁性物質(zhì)的弛豫率、［M］為溶液中順磁性物質(zhì)的摩爾濃度．當(dāng)R1值越大時(shí)表明其弛豫能力越強(qiáng)，即對(duì)水質(zhì)子的弛豫影響更大，活體的成像效果更好．

表1為釓配合物 Gd－DTPA－2APTMPyP在不同濃度（0．1～1．1 mmol／L）的水溶液中所測(cè)得的溶劑水分子氫核縱向弛豫時(shí)間T1，以及所計(jì)算出的相對(duì)應(yīng)的弛豫速率A，即1／T1．

圖6 Gd－DTPA－2APTMPyP在水溶液中的弛豫性能Fig．6 Relaxivity of Gd－DTPA－2APTMPyP in water solution

由Table 1的數(shù)據(jù)作圖（圖6），從圖中可知隨著配合物濃度的變化，溶劑中水分子中質(zhì)子的弛豫速率A呈線性變化．其中橫坐標(biāo)X為水溶液中配合物Gd－DTPA－2APTMPyP的摩爾濃度，縱坐標(biāo)Y為縱向弛豫時(shí)間T1的倒數(shù)，即弛豫速率．

表1 弛豫率數(shù)據(jù)Table 1 Experimental data of relaxivity

根據(jù)圖6的趨勢(shì)線做線性擬合，相關(guān)系數(shù)為0．999，得下式

對(duì)照上式，可見(jiàn) Gd－DTPA－2APTMPyP的弛豫率為4．798 mmol－1·L·s－1，該值高于 Gd－DTPA的弛豫率（3．687 mmol－1·L·s－1）．

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Gd－DTPA－2APTMPy P 對(duì)水質(zhì)子的弛豫速率有較好的加速作用，弛豫率較高，有利于獲得良好的成像效果．

2．4 釓配合物的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

從圖7可知，當(dāng)培養(yǎng)液中釓配合物質(zhì)量濃度為5μg／m L時(shí)，用含 Gd－DTPA培養(yǎng)液培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞的相對(duì)存活率為89%，而用含Gd－DTPA－2APTMPyP培養(yǎng)液培養(yǎng)的 HeLa細(xì)胞的相對(duì)存活率為89．8%；當(dāng)培養(yǎng)液中釓配合物質(zhì)量濃度為100μg／m L時(shí)，用含Gd－DTPA培養(yǎng)液培養(yǎng)的He La細(xì)胞的相對(duì)存活率為73%，而用含Gd－DTPA－2APTMPyP培養(yǎng)液培養(yǎng)的 HeLa細(xì)胞的相對(duì)存活率為60．0%．

圖7 釓配合物對(duì)HeLa細(xì)胞的體外毒性Fig．7 In vitro cytotoxicity assay of the gadolinium complex to HeLa cells

3 結(jié) 語(yǔ)

用二乙酸酐五乙酸（DTPA）脫水制得二乙酸酐五乙酸雙酸酐（DTPAA），再與卟啉化合物進(jìn)行反應(yīng)，合成小分子配體，然后與金屬釓離子進(jìn)行配合制得水溶性小分子造影劑．對(duì)所得的配體和配合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征與體外性能研究．實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與Gd－DTPA相比，這類(lèi)小分子磁共振成像造影劑具有較高的弛豫率，對(duì)He La細(xì)胞具有相似的體外細(xì)胞毒性．將進(jìn)一步研究小分子造影劑的腫瘤靶向性能與體內(nèi)外磁共振成像性能．

致謝

感謝國(guó)家自然科學(xué)基金委、武漢市科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目組、武漢工程大學(xué)第三屆研究生創(chuàng)新基金組的資助．

［1］陳小華，潘慶春．PTD－HBc Ag融合蛋白經(jīng)樹(shù)突狀細(xì)胞誘導(dǎo)特性CTL抑制HBV的體外研究［J］．細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2009，25（4）：289－292．

［2］湯俊琦，黃嘉敏．納米金在腫瘤診斷中的應(yīng)用［J］．材料導(dǎo)報(bào)，2012，26（9）：59－64．

［3］Fries P，Runge V M，Bqucker A，et al．Brain tumor enhancement in magnetic resonance imaging at 3 tesla：intraindividual comparison of two high relaxivity macromolecular contrast media with a standard extracellular Gd－chelate in rat brain tumor modal［J］．Invest Radiol，2009，44（4）：200－206．

［4］黃素英，張婷．冠脈造影劑腎病水化干預(yù)護(hù)理探討［J］．護(hù)士進(jìn)修雜志，2011，26（8）：698－700．

［5］王兆星．造影劑腎病早期診斷的生物標(biāo)志物［J］．腎臟病與透析腎移植雜志，2011，20（3）：275－279．

［6］Yan G P，Zhuo R X．Liver－targeting macromolecular MRI contrast agents［J］；Science in China：Series B，2001，44（4）：344－352．

［7］Yan G P，Liu M L．Polyaspartamide Gadolinium Complexes Containing Sulfadiazine Groups as Potential Macromolecular MRI Contrast Agents［J］．Bioconjugate Chem，2005，16（4）：967－971．

［8］Yan G P，Ai C W，Li L，et al．Dendrimers as Carriers for Contrast Agents in Magnetic Resonance Imaging［J］．Chinese Science Bulletin，2010，55（27／28 ）：3237－3243．

［9］侯長(zhǎng)軍，郝燕，霍丹群．卟啉及其衍生物抗癌活性機(jī)理研究進(jìn)展［J］．生物醫(yī)學(xué)工程研究，2007，26（1）：97－100．

［10］Shahbazi－Gahrouei D，Williams M，Rizvi S，et al．In Vivo Studies of Gd－DTPA－monoclonal Antibody and Gd－porphyrins：Potential Magnetic Resonance Imaging Contrast Agents for Melanoma［J］．J Magn Reson Imaging，2001，14：169－174．

［11］Young S W，Sidhu M K，Qing F．Preclinical Evaluation of Gadolinium （III）Texaphyrin Complex：a New Paramagnetic Contrast Agent for Magnetic Resonance Imaging［J］．Invest Radiol，1994，29：330－338．

［12］Hofmann B，Bogdanov A，Marecos E，et al．Mechanism of Gadophrin－2 Accumulation in Tumor Necrosis［J］．J Magn Reson Imaging，1999，9：336－341．

［13］石偉民 ，劉衛(wèi)敏 ，陶京朝．用于光動(dòng)力治療的四苯基卟啉衍生物研究進(jìn)展［J］．化學(xué)研究，2005，16（2）：101－105．

［14］Yan G P，Li Z，Xu W，et al．Porphyrin－containing Polyaspartamide Gadolinium Complexes as Potential Magnetic Resonance Imaging Contrast Agents［J］．International Journal of Pharmaceutics，2011，407：119－125．

［15］張麗民，陳杞．螯合劑DTPAA的合成及應(yīng)用［J］．化學(xué)世界，1992，33（2）：70－72．

［16］Hnatowich D J，Layne W W．The preparation and labeling of DTPA－coupled albumin［J］．Int J Appl Radiat Isot，1982，33（5）：327－332．

［17］Dong－Fang S，Richard T W，Daekyu S，et al．Laurence H． Hurley． Quadruplex－Interactive Agents as Telomerase Inhibitors：Synthesis of Porphyrins and Structure－Activity Relationship for the Inhibition of Telomerase［J］．J Med Chem，2001，44（26）：4509－4523．