張 建，顧 茵，羅學(xué)勝，陳 穗，楊 忠，李紅麗，蔡文琴

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Wnt信號(hào)通路分子在大鼠神經(jīng)干細(xì)胞分化過(guò)程中的表達(dá)

張 建1，顧 茵1，羅學(xué)勝1，陳 穗1，楊 忠2*，李紅麗2，蔡文琴2

（1解放軍第113醫(yī)院干部病房，寧波 315040；2解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，重慶 400038）

觀察Wnt信號(hào)通路主要分子[β-連環(huán)蛋白（β-catenin）和糖原合酶激酶-3β（GSK-3β）]在神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）體系的表達(dá)及其在增殖和分化過(guò)程中的變化，探討其在神經(jīng)干細(xì)胞分化中可能的調(diào)控作用。采用原代培養(yǎng)方法，自14～16d大鼠胚胎大腦皮后獲得含大量細(xì)胞團(tuán)的NSCs體系。應(yīng)用含10%胎牛血清培養(yǎng)液誘導(dǎo)NSCs分化。Western印跡檢測(cè)NSCs在加入胎牛血清12，24，48和72h后，β-catenin與GSK-3β在分化過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化。免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示NSCs細(xì)胞團(tuán)及散在的單個(gè)細(xì)胞多呈巢蛋白（nestin）陽(yáng)性，顯示NSCs分化過(guò)程中兩者存在持續(xù)表達(dá)，β-catenin分子表達(dá)呈現(xiàn)逐漸減少趨勢(shì)，而GSK-3β分子表達(dá)則呈現(xiàn)逐漸增加趨勢(shì)。提示W(wǎng)nt信號(hào)通路與NSCs的增殖和分化過(guò)程密切相關(guān)，呈現(xiàn)出由活躍到逐步抑制的過(guò)程，為研究Wnt信號(hào)通路參與NSCs增殖分化調(diào)控的機(jī)制提供了載體。

Wnt信號(hào)通路；β-連環(huán)蛋白；糖原合酶激酶-3β；神經(jīng)干細(xì)胞；免疫細(xì)胞化學(xué)

Wnt信號(hào)通路是細(xì)胞增殖分化的關(guān)鍵調(diào)控環(huán)節(jié)，β-連環(huán)蛋白（β-catenin）是經(jīng)典Wnt信號(hào)通路主要的胞漿內(nèi)效應(yīng)分子，糖原合酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）主要作用是使游離的β-catenin磷酸化[1]。該通路廣泛參與了包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞命運(yùn)特化、細(xì)胞極性及細(xì)胞遷移等生物學(xué)過(guò)程，在胚胎發(fā)育和腫瘤發(fā)生中有著重要作用[2]。神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cells，NSCs）作為神經(jīng)系統(tǒng)組織細(xì)胞的前體，有關(guān)其增殖分化過(guò)程分子機(jī)制的研究是近年神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域備受關(guān)注的焦點(diǎn)[3]。目前對(duì)Wnt信號(hào)通路在NSCs增殖、分化與細(xì)胞命運(yùn)決定等過(guò)程中的作用，文獻(xiàn)報(bào)道存在較大差異。在哺乳類神經(jīng)系統(tǒng)，幾年來(lái)Wnt信號(hào)通路對(duì)神經(jīng)管和神經(jīng)嵴細(xì)胞增殖、凋亡及命運(yùn)決定的調(diào)控作用逐步受到關(guān)注[4]，如早期對(duì)神經(jīng)管及神經(jīng)嵴等的研究中提示W(wǎng)nt信號(hào)分子能促進(jìn)神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖與發(fā)生[5]。本研究旨在探討Wnt信號(hào)通路分子在NSCs的增殖、分化和命運(yùn)決定中究竟發(fā)揮何種作用，它們?cè)诓煌l(fā)育階段或不同的前體細(xì)胞類型中是否存在差異。此方面的研究不僅有助于闡明NSCs的增殖分化機(jī)制，還將有可能為維持NSCs原始增殖狀態(tài)、阻止其分化提供新的線索。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)用孕13～16d Wistar大鼠共18只，平均體質(zhì)量（350±20）g，由第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 主要試劑及儀器

β-catenin和GSK-3β多克隆抗體（兔血清）為美國(guó)Santa Cruz公司產(chǎn)品，巢蛋白（nestin），膠質(zhì)原纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP），神經(jīng)絲（neurofilament）和微管相關(guān)蛋白（microtubule associated protein，MAP）一抗為美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)的小鼠血清來(lái)源的單克隆抗體，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG，購(gòu)自武漢博士德公司，蛋白裂解液（RIPA，PMSF）購(gòu)自上海申能博彩生物科技公司，DMEM/F12培養(yǎng)基購(gòu)自于美國(guó)Gibco公司，優(yōu)質(zhì)胎牛血清購(gòu)自于奧地利PAA公司，胰蛋白酶購(gòu)自于美國(guó)Sigma公司。解剖顯微鏡為德國(guó)Leica儀器公司產(chǎn)品；高速臺(tái)式離心機(jī)為Sartorius 1-15 Sigma，德國(guó)；液氮貯存罐為YDS-30-125，四川亞西機(jī)械廠；紫外分光光度儀為U-1800 HITACHI，日本；5%CO237℃培養(yǎng)孵箱為SeriesⅡ 3111型，美國(guó)；超凈工作臺(tái)為Air Tech HS-1300-V，中國(guó)蘇州；凝膠成像分析系統(tǒng)為SK 300，上海生物技術(shù)公司；數(shù)碼攝像系統(tǒng)為OLYMPUS DP70，倒置相差顯微鏡為OLYMPUS IX51，倒置相差熒光顯微鏡為OLYMPUS IX70，均日本。

1.3 大鼠胚胎大腦皮層NSCs的分離培養(yǎng)

（1）取孕13～16d Wistar大鼠1只，1%的戊巴比妥鈉30mg/kg腹腔注射麻醉后，碘酊和乙醇消毒腹部皮膚；（2）在準(zhǔn)備室內(nèi)用無(wú)菌手術(shù)剪依次剪開(kāi)下腹部皮膚、肌肉和腹膜，暴露兩側(cè)子宮，順子宮分離至子宮角處剪下，放入培養(yǎng)皿中，D-Hanks液中漂洗；（3）依次去掉子宮壁及胎膜，取胎鼠于75%的乙醇中浸泡進(jìn)行皮膚消毒；（4）用眼科剪剪開(kāi)頭皮和顱骨，剝離暴露出胎鼠大腦，取皮質(zhì)組織；（5）在解剖顯微鏡下，去除腦膜，剪成約1.5mm×2.0mm×1.0mm大小的組織塊，置于D-Hanks液中直接吹打成單細(xì)胞懸液，種植入50ml培養(yǎng)瓶中，每瓶細(xì)胞數(shù)約為1×106個(gè)。培養(yǎng)條件：DMEM/F12＋20ml/L 50×B27＋20ml/L bFGF，37℃，5%CO2。待原代神經(jīng)細(xì)胞球（neurosphere）形成較多時(shí)（約4～5d）進(jìn)行傳代。本實(shí)驗(yàn)中主要使用第3代和第4代細(xì)胞，巢蛋白免疫熒光染色鑒定NSCs性狀。同時(shí)用含10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的DMEM/F12培養(yǎng)液對(duì)NSCs進(jìn)行誘導(dǎo)分化，后分別以神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的特異標(biāo)志物神經(jīng)絲及GFAP抗體鑒定其多向分化潛能。

1.4 NSCs的傳代培養(yǎng)

將培養(yǎng)的細(xì)胞集落收集入離心管中，800～1000r/min離心2～5min，棄上清液，加入少量條件培養(yǎng)液，用吸管反復(fù)吹打細(xì)胞集落，盡量使其分散，計(jì)數(shù)細(xì)胞后（2×106個(gè)細(xì)胞/瓶）置入50ml培養(yǎng)瓶中，加NSCs條件培養(yǎng)液6～7ml，置37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)，依據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)快慢進(jìn)行傳代。在傳代過(guò)程中，盡量吹散，但也不能過(guò)猛，以免影響其克隆的生長(zhǎng)。

1.5 NSCs免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定

（1）將培養(yǎng)的干細(xì)胞團(tuán)用4%多聚甲醛固定30min后涂在載玻片上，在37℃孵箱中烘干；（2）0.01mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）漂洗5min×3次，0.3%TritonX-100，室溫20min，兔抗巢蛋白IgG，37℃孵育，1h后轉(zhuǎn)入4℃過(guò)夜；（3）0.01mol/L PBS漂洗5min×3次，F(xiàn)ITC-抗兔IgG，37℃，2h；（4）0.01mol/L PBS漂洗5min×3次，漂洗后甘油封片，在熒光顯微鏡下觀察。陰性對(duì)照：用0.01mol/L PBS或與二抗同種動(dòng)物血清代替一抗進(jìn)行，其他步驟不變。

1.6 NSCs的分化

（1）設(shè)立NSCs對(duì)照組，同時(shí)在NSCs培養(yǎng)瓶中加入含10%FBS清誘導(dǎo)其分化，觀察干細(xì)胞的變化；（2）分別于分化12，24，48和72h終止培養(yǎng)，通過(guò)相差顯微鏡觀察NSCs在分化過(guò)程中的形態(tài)變化，同時(shí)成像；（3）收集NSCs以及誘導(dǎo)分化后12，24，48和72h一共5個(gè)時(shí)相點(diǎn)的細(xì)胞，先將培養(yǎng)的細(xì)胞收集入離心管中，800～1000r/min離心2～5min，棄上清液；（4）再將收集了細(xì)胞的EP管置于液氮中冷凍5～10min；最后將細(xì)胞收集于1.5ml離心管（即EP管），置-80℃冰箱中冷凍保存，用于Western blotting實(shí)驗(yàn)中提取細(xì)胞蛋白。

1.7 Western blotting

（1）快速取所需組織，液氮冷凍、研缽粉碎，加入苯甲磺酰氟（PMSF，每克組織30μl），冰上孵育30min；（2）移入離心管，4℃離心（150×）15min，取上清；（3）將0.5g/L標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液稀釋為6個(gè)濃度，以蛋白濃度為橫坐標(biāo),以吸光度值為縱坐標(biāo)作曲線；（4）考馬斯亮藍(lán)染色測(cè)定蛋白濃度，取待測(cè)樣品進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)其吸光度值計(jì)算蛋白濃度；（5）用圖像分析軟件對(duì)掃描結(jié)果進(jìn)行分析，得到平均吸光度值。（6）每個(gè)樣品取10μl蛋白質(zhì)加入10μl上樣緩沖液，100℃一起煮沸5min，進(jìn)行定性SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳；（7）然后移至PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液沖洗，4℃孵育過(guò)夜；（8）PVDF膜在室溫下與β-catenin抗體（1∶2000）孵育1h，漂洗后入生物素化二抗（1∶2000）室溫下孵育1h，每次孵育之間均用TBST緩沖液沖洗3次，每次10min；（9）二氨基聯(lián)苯胺（3,3’-diaminobenzidine，DAB）顯色，掃描記錄。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)分析采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件包。計(jì)量資料的比較采用檢驗(yàn)。＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 NSCs的培養(yǎng)和鑒定

原代培養(yǎng)細(xì)胞在無(wú)血清的NSCs培養(yǎng)液中2～3d內(nèi)部分死亡，其余大部分逐步分裂形成多細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)，繼續(xù)培養(yǎng)后細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，細(xì)胞團(tuán)數(shù)目迅速增多增大，成懸浮球團(tuán)狀生長(zhǎng)，無(wú)突起?？寺鞔囵B(yǎng)后也形成類似于原代的細(xì)胞團(tuán)（圖1）。免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示細(xì)胞團(tuán)及散在的單個(gè)細(xì)胞多呈巢蛋白陽(yáng)性（圖2）。血清誘導(dǎo)分化后NSCs團(tuán)在12h內(nèi)即貼壁并開(kāi)始發(fā)出突起，隨后有細(xì)胞向外遷移，2～3d內(nèi)細(xì)胞突起即非常明顯，彼此連接形成網(wǎng)絡(luò)，越往后細(xì)胞分散越為明顯（圖3）。分化的細(xì)胞形態(tài)多樣，通過(guò)細(xì)胞特異性抗原的免疫熒光鑒定，部分細(xì)胞呈現(xiàn)GFAP陽(yáng)性，為星形膠質(zhì)細(xì)胞，部分呈現(xiàn)MAP2陽(yáng)性，為神經(jīng)元。提示所得細(xì)胞為具有良好增殖能力和多向分化潛能的NSCs體系（圖4）。

分化后細(xì)胞大致有3種類型：（1）具有數(shù)個(gè)粗大突起的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞，胞體較寬大，折光性弱；（2）具有1～2個(gè)突起，胞體呈圓形或橢圓形的神經(jīng)元樣細(xì)胞，細(xì)胞較小，突起短而少，細(xì)胞分散排列，折光性強(qiáng)；（3）具有多個(gè)細(xì)長(zhǎng)突起的少突膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞，細(xì)胞大小介于前二者之間。

2.2 NSCs分化過(guò)程中Wnt信號(hào)分子表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化

Western blotting結(jié)果顯示，在NSCs血清誘導(dǎo)分化12，24，48和72h各組中均存在著β-catenin和GSK-3β的持續(xù)表達(dá)，隨著NSCs分化時(shí)間的延長(zhǎng)，β-catenin平均吸光度值呈現(xiàn)梯度減少，表示β-catenin量呈現(xiàn)梯度下降（＜0.05；圖5）。從NSCs對(duì)照組開(kāi)始，隨著NSCs分化時(shí)間的延長(zhǎng)，GSK-3β蛋白平均吸光度值呈現(xiàn)梯度增加，表示GSK-3β量呈現(xiàn)梯度增加（＜0.05；圖6）。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理顯示各組之間存在明顯差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：NSCs在加入10%FBS以后，伴隨NSCs的分化時(shí)間逐漸延長(zhǎng)，β-catenin在NSCs分化細(xì)胞中的表達(dá)呈現(xiàn)梯度減少，而GSK-3β在NSCs分化細(xì)胞中的表達(dá)呈現(xiàn)梯度增加。圖7為β-catenin與GSK-3β兩類分子動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)圖。

圖1 培養(yǎng)3d懸浮生長(zhǎng)的NSCs

Figure 1 Neural stem cells cultured for 3 days (×200)

圖2 NSCs的鑒定

Figure 2 Identification of neural stem cells by immunofluorescence technique using anti-Nestin (FITC×200)

圖3 FBS誘導(dǎo)分化2d的NSCs

Figure 3 Neural stem cells differentiated for 2 days using 10% fetal bovine serum (×200)

圖4 誘導(dǎo)分化7d的NSCs的雙標(biāo)鑒定(Anti-MAP2 FITC/ Anti-GFAP Cy3)

Figure 4 Double staining identification of neural stem cells after differentiation for 7 days using anti-MAP2 and anti-GFAP (FITC×200)

圖5 加入10%胎牛血清后NSCs分化過(guò)程β-catenin的Western blotting分析

Figure 5 Western blotting analysis of dynamic changes of β-catenin in the differentiation of neural stem cells cultured in media containing 10% fetal bovine serum Along with the extension of the time of differentiation, the level of β-catenin decreases gradually

圖6 加入10%胎牛血清后NSCs分化過(guò)程GSK-3β的Western blotting分析

Figure 6 Western blotting analysis of dynamic changes of GSK-3β in the differentiation of NSCs cultured in media containing 10% FBS Along with the extension of the time of differentiation, the level of GSK-3β increases gradually

圖7 NSCs誘導(dǎo)分化過(guò)程中不同時(shí)相點(diǎn)GSK-3β與β-catenin的表達(dá)

Figure 7 Dynamic expression of β-catenin and GSK-3β during differentiation of cultured NSCs

3 討 論

近年來(lái)，對(duì)NSCs的研究已經(jīng)成為神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)，尤其近年研究發(fā)現(xiàn)，NSCs不僅存在于胚胎神經(jīng)組織，同樣存在于成體的中樞神經(jīng)系統(tǒng)[6]。人們希望通過(guò)闡明NSCs增殖分化的調(diào)控機(jī)制，使其定向神經(jīng)細(xì)胞分化，將有可能實(shí)現(xiàn)NSCs應(yīng)用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)移植或替代治療，以及發(fā)現(xiàn)調(diào)控神經(jīng)發(fā)生等的手段[7]，也有可能為部分中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病和中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷等疾病的治療帶來(lái)希望。目前在NSCs分化調(diào)控機(jī)制的研究中已獲得一些重要線索，如發(fā)現(xiàn)Notch蛋白的主要作用為抑制干細(xì)胞的神經(jīng)元方向分化，而促進(jìn)向膠質(zhì)細(xì)胞方向分化，bHLH基因家族對(duì)NSCs的作用與Notch蛋白正好相反[8]。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中從胎大鼠大腦皮質(zhì)獲得了NSCs，另外使用神經(jīng)上皮細(xì)胞的特異性抗原巢蛋白的抗體來(lái)證明我們所分離的細(xì)胞為胚胎早期細(xì)胞。在利用10%FBS誘導(dǎo)以后，再使用星形膠質(zhì)細(xì)胞的特異性抗體GFAP和神經(jīng)元細(xì)胞的特異性抗體即MAP2，來(lái)證明所獲得的細(xì)胞群可以分化為神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞等多種神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞。因此，本實(shí)驗(yàn)中分離的細(xì)胞群具有良好的增殖能力和多項(xiàng)分化的潛能，具備了NSCs的基本屬性，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的干細(xì)胞，為NSCs的定向分化提供了基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)資料。

目前，盡管關(guān)于Wnt蛋白在神經(jīng)系統(tǒng)早期發(fā)育包括神經(jīng)前體細(xì)胞增殖分化中的調(diào)控作用已有一系列的文獻(xiàn)報(bào)道，但有關(guān)Wnt信號(hào)通路下游分子β-catenin和GSK-3β等在NSCs增殖、分化與細(xì)胞命運(yùn)決定等過(guò)程中的作用，文獻(xiàn)報(bào)道存在較大差異。如有基于Wnt信號(hào)分子基因敲除的實(shí)驗(yàn)觀察中顯示，Wnt通路的激活即β-catenin信號(hào)分子的表達(dá)增強(qiáng)能促進(jìn)NSCs的增殖并阻抑其分化[9]，而有在神經(jīng)嵴細(xì)胞及皮質(zhì)前體細(xì)胞的研究則認(rèn)為Wnt信號(hào)分子主要是NSCs的一個(gè)分化誘導(dǎo)因子[10]。而在Holowacz等[11]的研究中發(fā)現(xiàn)，封閉了β-catenin基因的NSCs也保持著多向分化潛能，包括有能力可以克隆分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。這一研究結(jié)果卻表明，β-catenin對(duì)于NSCs的增殖和分化不是必須的，但是對(duì)于神經(jīng)前體細(xì)胞的黏附和存活是必須的。因此，在NSCs增殖和分化過(guò)程中，Wnt信號(hào)通路分子的表達(dá)和動(dòng)態(tài)變化的研究非常有意義，在各種外源性因素和細(xì)胞因子的影響下，Wnt信號(hào)通路在NSCs的增殖和分化過(guò)程中，是部分參與、不參與或者是起決定性作用，對(duì)此值得進(jìn)一步研究和探討。

為了更好地闡明Wnt信號(hào)通路中β-catenin和GSK-3β等調(diào)控分子在NSCs增殖分化過(guò)程中的作用，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立離體的NSCs培養(yǎng)體系，首先應(yīng)用含10%FBS培養(yǎng)液誘導(dǎo)NSCs分化，為探討NSCs增殖和分化的機(jī)制提供了穩(wěn)定的載體，其次觀察了NSCs血清誘導(dǎo)分化過(guò)程中主要Wnt信號(hào)分子的動(dòng)態(tài)表達(dá)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著NSCs分化的進(jìn)行，β-catenin表達(dá)量逐漸減少，而GSK-3β蛋白表達(dá)量逐漸增加；顯示了一個(gè)Wnt信號(hào)通路由活化狀態(tài)逐步走向抑制的過(guò)程。也提示β-catenin，GSK-3β與NSCs增殖和分化存在著密切的關(guān)系，它們可能是胚胎發(fā)育過(guò)程中NSCs增殖與分化的關(guān)鍵調(diào)控因子。有的研究顯示腦神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)于離體的NSCs分化為神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞的作用，最可能就是通過(guò)激活Wnt信號(hào)通路[12]。巨細(xì)胞病毒的感染造成大鼠胚胎神經(jīng)系統(tǒng)的畸形，被證實(shí)顯著地抑制NSCs的增殖與分化，也是通過(guò)抑制Wnt信號(hào)通路的關(guān)鍵分子的表達(dá)來(lái)影響NSCs的分化[13]。這與我們的研究結(jié)果是相一致的，NSCs的分化可能受到眾多因素的影響，但是各種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞黏附因子和外源性因素在NSCs分化過(guò)程中通過(guò)激活Wnt信號(hào)通路的關(guān)鍵點(diǎn)究竟在哪里還有待于進(jìn)一步的觀察，它的下游調(diào)控機(jī)制依然沒(méi)有完全闡述。另外有必要在進(jìn)一步干擾和封閉Wnt信號(hào)通路后，進(jìn)行流式細(xì)胞儀監(jiān)測(cè)和計(jì)數(shù)以繼續(xù)觀察NSCs分化細(xì)胞數(shù)比例改變的情況，以進(jìn)一步論證相關(guān)的研究結(jié)果。

Lie等[14]發(fā)現(xiàn)，成年海馬NSCs或者神經(jīng)前體細(xì)胞均表達(dá)Wnt蛋白的受體（Fz）和相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)控分子，結(jié)合既往一系列研究，顯示NSCs具有接受Wnt信號(hào)分子調(diào)控的物質(zhì)基礎(chǔ)。血清誘導(dǎo)NSCs分化代表其逐步失去強(qiáng)大增殖能力與多向分化潛能，基因水平可理解為部分基因的特異性關(guān)閉，而另一些基因出現(xiàn)表達(dá)，β-catenin和GSK-3β在此分化過(guò)程的相反變化即符合這一原則。但血清誘導(dǎo)如何導(dǎo)致GSK-3β表達(dá)的上調(diào)，從而導(dǎo)致Wnt信號(hào)通路的主要胞漿內(nèi)效應(yīng)分子的抑制，是否也經(jīng)由Fz受體步驟，還有待研究。總之，結(jié)合其他的各項(xiàng)研究結(jié)果，雖然有的研究認(rèn)為NSCs的增殖和分化可能是通過(guò)Notch通路、STAT3通路等信號(hào)通路在發(fā)揮調(diào)控作用，Wnt信號(hào)通路僅對(duì)于NSCs的黏附作用是必須的。但是，我們?cè)谘芯恐姓J(rèn)為，Wnt信號(hào)通路分子一直調(diào)控NSCs的功能和發(fā)育，與NSCs的增殖和分化過(guò)程是密切相關(guān)的。如果能夠激活Wnt信號(hào)通路的活動(dòng)，是否可以通過(guò)調(diào)控下游Wnt信號(hào)通路分子的表達(dá)來(lái)抑制神經(jīng)發(fā)生的過(guò)程，從而導(dǎo)致NSCs增殖的加強(qiáng)，還需要以后的研究加以驗(yàn)證。

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（編輯: 金美娜, 王雪萍）

Expression profiles of Wnt signaling molecules in differentiation process of rat neural stem cells

ZHANG Jian1, GU Yin1, LUO Xue-Sheng1, CHEN Sui1, YANG Zhong2*, LI Hong-Li2, CAI Wen-Qin2

(1Department of Geriatrics, Chinese PLA Hospital No.113, Ningbo 315040, China;2Department of Histology and Embryology, College of Basic Medical Sciences, the Third Military Medical University, Chongqing 400038, China)

To determine the expression profiles of main molecules in Wnt signal pathway, β-catenin and glycogen synthase kinase-3β (GSK-3β), in the proliferation and differentiation process of neural stem cells (NSCs), and to investigate the possible regulating role of these molecules in the process.The NSCs were isolated and primarily cultured from rat fetus at an embryonic age of 14 to 16d according to reported methods. At 12 to 24h after cultured in the medium containing 10% fetal bovine serum (FBS), the cells attached and grew gradually. Western blotting was used to measure the protein levels of β-catenin and GSK-3β in the cells treated in the FBS medium or control after 12, 24, 48 and 72 hours treatment.Immunofluorescence assay indicated that the cultured neurospheres or single cells were positive with nestin. Western blotting results revealed a continuous expression of β-catenin and GSK-3β in the differentiation of the cultured NSCs. β-catenin was in a gradual decreasing tendency, whereas GSK-3β showed an opposite change.Wnt signaling pathway is involved in the proliferation and differentiation of NSCs, and is active first and then gradually inhibited. These confirm the NSCs biological property of the culturing cells and provide a model for studying the role of Wnt signaling molecules.

Wnt signaling pathway; β-catenin; glycogen synthase kinase-3β; neural stem cells; immunocytochemistry

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R322.81

A

10.3724/SP.J.1264.2013.00235

2013?07?30;

2013?08?28

第三軍醫(yī)大學(xué)回國(guó)人員啟動(dòng)基金

楊 忠, E-mail: yangzhong1999@163.com