張松筠, 楊長春, 王瑞英, 張力輝, 李彩格, 姜慧卿

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GLP-1可拮抗Ghrelin對離體大鼠胰島分泌胰島素的抑制

張松筠1, 楊長春2, 王瑞英1, 張力輝1, 李彩格1, 姜慧卿*3

（河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院:1內(nèi)分泌科,3消化內(nèi)科, 石家莊 050000;2武警總醫(yī)院南樓一科, 北京 100039）

Ghrelin; 胰高血糖素樣肽-1; 大鼠; 胰島; 胰島素

胰島素是機(jī)體調(diào)節(jié)血糖水平的主要激素。Ghrelin主要由胃分泌，可增進(jìn)食欲，促進(jìn)能量正平衡，調(diào)節(jié)血糖水平，諸多研究證明，Ghrelin可明顯抑制葡萄糖刺激的胰島素分泌[1-3]。胰高血糖素樣肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）由腸道分泌，可以抑制胃腸動(dòng)力，減慢胃排空速率，減少胰島β細(xì)胞凋亡，促進(jìn)胰島β細(xì)胞的增殖和分化，刺激胰島素分泌[4-6]。本實(shí)驗(yàn)采用體外培養(yǎng)的方法，觀察GLP-1及Ghrelin對離體大鼠胰島分泌胰島素的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SD大鼠（200g左右），河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物室提供（合格證編號(hào)DK0408-0089）。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

Ghrelin（Phoenix公司），GLP-1（Bachem公司），膠原酶V（Sigma公司），胎牛血清（Hyclone公司），F(xiàn)icoll（Pharmacia公司），RPMI 1640培養(yǎng)液（Hyclone公司），HEPES-緩沖液、PBS、葡萄糖、平衡鹽溶液、Hanks液、雙硫腙染料（河北博海生物工程有限公司），胰島素放射免疫藥盒（中國原子能科學(xué)院同位素研究所）。

1.3 胰島分離消化[7]

SD大鼠，脫頸處死后于無菌條件下取出胰腺，置于37℃Hank￠s液中剪碎（1mm×1mm×1mm大?。尤肽z原酶V（1g/L），在37℃的恒溫水浴箱中振蕩消化至瓶內(nèi)組織成糊狀，并立即吸出細(xì)顆粒狀組織，4℃Hank￠s液終止消化。收集上層細(xì)胞懸液，過500目濾網(wǎng)，離心5min（1000r/min），棄上清液。將分離所得胰島細(xì)胞懸浮于4ml 25%的Ficoll-400分離液中，為建立密度梯度，依次加入23.0%、20.5%和11.0%的Ficoll-400分離液各2ml，4℃離心（15min，800r/min），收集1.077、1.084 kg/L，1.068、1.077kg/L與1.038、1.068 kg/L界面的細(xì)胞團(tuán)，洗滌后取少量做雙硫腙染色，10 min后鏡檢，鑒定為胰島后，手挑法顯微鏡下取出直徑50μm以上的胰島。

1.4 孵育

將分離所得胰島置于37℃、5% CO2恒溫箱中，應(yīng)用RPMI 1640（含10%胎牛血清）孵育過夜，之后換入含3.3mmol/L葡萄糖的HEPES-緩沖液預(yù)孵1h（對照組），去上清，再分別移入葡萄糖液（高糖組）、葡萄糖+Ghrelin液（Ghrelin組）、葡萄糖+GLP-1液（GLP-1組）、葡萄糖+Ghrelin+GLP-1液（Ghrelin+GLP-1組）繼續(xù)孵育1h，提取上清液，應(yīng)用放射免疫法測定胰島素濃度。孵育液中葡萄糖濃度為16.7mmol/L，Ghrelin濃度為10-6mmol/L，GLP-1濃度為10-3mmol/ L。每組12孔，每孔約含10個(gè)胰島。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 胰島成功分離消化

應(yīng)用胰島分離消化的方法分離胰島細(xì)胞，經(jīng)雙硫腙染色10 min后鏡檢鑒定為胰島（圖1），用于實(shí)驗(yàn)。

圖1 分離純化后的胰島細(xì)胞團(tuán)

Figure 1 Separated and purified islet cell mass (dithizone staining ×200)

2.2 Ghrelin對高糖誘導(dǎo)的胰島素分泌的影響

圖2結(jié)果表明，高糖組胰島素濃度為（18.12±4.71）mmol/L，與對照組（7.37±0.17）mmol/L相比明顯升高（＜0.01），證實(shí)高濃度葡萄糖（16.7mmol/L）可刺激胰島分泌胰島素。

Ghrelin組胰島素濃度為（11.93±3.57）mmol/L，與高糖組相比明顯降低（＜0.05），提示10-6mmol/L的Ghrelin對高濃度葡萄糖刺激的胰島素分泌有顯著的抑制作用。

GLP-1組胰島素濃度為（27.29±8.12）mmol/L，明顯高于高糖組（＜0.05），提示10-3mmol/L的GLP-1可以顯著增強(qiáng)高濃度葡萄糖刺激的胰島素分泌。

GLP-1+Ghrelin組胰島素濃度為（16.7±5.34）mmol/L，明顯高于Ghrelin組（＜0.05）。提示10-3mmol/ L的GLP-1可拮抗10-6mmol/L Ghrelin對高糖誘導(dǎo)的胰島素分泌的抑制作用。

圖2 Ghrelin對高糖誘導(dǎo)的胰島素分泌的影響

Figure 2 The effect of Ghrelin on high glucose-induced insulin secretion

與對照組比較,**＜0.01; 與高糖組比較,#＜0.05; 與Ghrelin組比較,△＜0.05

3 討 論

Ghrelin是生長激素促泌劑受體（growth hormone secretagogue receptor，GHS-R）的內(nèi)源性配體，具有廣泛的生理功能。循環(huán)中70%的Ghrelin來源于胃粘膜，但RT-PCR、免疫組化、原位雜交等多種實(shí)驗(yàn)均證實(shí)Ghrelin同樣存在于胰島[7]，并可以通過旁分泌或自分泌的方式抑制高糖誘導(dǎo)的胰島素分泌。本實(shí)驗(yàn)中Ghrelin組胰島素濃度明顯低于高糖組，再次證實(shí)這一結(jié)論。

GLP-1由小腸L-型內(nèi)分泌細(xì)胞在食物中的碳水化合物和脂肪的刺激下分泌，可以促進(jìn)胰島素分泌，抑制胰升糖素釋放。近來研究表明GLP-1還可阻止胰島β細(xì)胞凋亡，促進(jìn)β細(xì)胞新生。本實(shí)驗(yàn)中GLP-1組胰島素濃度明顯高于高糖組（＜0.05），證實(shí)10-3mmol/L的GLP-1可刺激胰島β細(xì)胞，顯著增加胰島素分泌。

本研究顯示，當(dāng)10-6mmol/L Ghrelin與10-3mmol/L GLP-1共同作用于胰島β細(xì)胞時(shí)，胰島素分泌明顯高于Ghrelin組。提示：10-3mmol/L GLP-1可以拮抗10-6mmol/ L Ghrelin對胰島素分泌的抑制。

[1] Sakurada T, Ro S, Onouchi T,. Comparison of the actions of acylated ghrelin on acid secretion in the rat stomach[J]. J Gastroenterol, 2010, 45(11): 1111-1120.

[2] Meyer C. Final answer: Ghrenlin can suppress insulin secretion in humans，but is it clinically relevant[J]? Diabetes, 2010, 59(11): 2726-2728.

[3] Vestergaard ET, Djurhuus CB, Gjedsted J,. Acute effects of Ghrelin administration on glucose and lipid metabolism[J]. J Clin Endocrinol Metab, 2008, 93(2): 438-444.

[4] 王慶美, 季 紅, 榮海欽, 等. 不同胰島素促泌劑對胰島β細(xì)胞凋亡的影響[J]. 醫(yī)學(xué)研究雜志, 2010, 39(3): 97-101.

[5] 劉玉溥, 呂慶國, 童南偉. 大鼠胰島β細(xì)胞分離與原代培養(yǎng)方法探討[J]. 四川大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版), 2009, 40(1): 153-156.

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[7] 陳 芳, 馬鳳霞, 池 穎, 等. 一種高效誘導(dǎo)胚胎胰腺細(xì)胞分化為內(nèi)分泌細(xì)胞培養(yǎng)方法的建立[J]. 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào), 2012, 34(4): 343-347.

（編輯: 周宇紅）

R587.1

A

10.3724/SP.J.1264.2013.00037

2012-11-25;

2012-11-25

河北省科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展項(xiàng)目（No. 062761834）

姜慧卿, Tel: 0311-66002955, E-mail: huiqingjiang@yahoo.com.cn