尹俊濱, 張 婷, 周科成, 王莉穎, 夏 亮, 胡 偉, 王 文*

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福爾馬林致痛后小鼠不同腦區(qū)內(nèi)FOS蛋白的表達

尹俊濱1, 張 婷1, 周科成2, 王莉穎1, 夏 亮3, 胡 偉1, 王 文1*

（第四軍醫(yī)大學:1人體解剖與組織胚胎學教研室, 梁銶琚腦研究中心;3航空航天醫(yī)學系心理學教研室, 西安 710032;2中國藥科大學中藥復(fù)方研究室, 南京 211198）

探討小鼠足底注射福爾馬林致痛后不同腦區(qū)內(nèi)FOS蛋白的表達情況。將5%福爾馬林溶液注射到小鼠后肢足底皮下，觀察注射后60min內(nèi)小鼠的自發(fā)痛反應(yīng)；用免疫組織化學染色技術(shù)觀察注射后2h同側(cè)脊髓背角及不同腦區(qū)內(nèi)FOS蛋白陽性神經(jīng)元的分布情況和數(shù)量。行為學結(jié)果顯示：注射福爾馬林60min后小鼠的舔/咬足時間及縮足次數(shù)呈現(xiàn)典型的雙相變化。免疫組織化學檢測結(jié)果顯示：注射福爾馬林2h后同側(cè)脊髓背角、下丘腦室旁核、丘腦中間背側(cè)核、前扣帶回皮質(zhì)、島葉皮質(zhì)及杏仁核內(nèi)FOS陽性神經(jīng)元的數(shù)量明顯增加，同時海馬齒狀回區(qū)FOS蛋白的表達也有一定程度的增加。在受到傷害性疼痛刺激時除了脊髓背角，感受疼痛、應(yīng)激及做出防御反應(yīng)的相應(yīng)腦區(qū)也會被活化，表達FOS蛋白。

c-fos; FOS蛋白; 福爾馬林痛; 免疫組織化學染色; 腦內(nèi)核團

C-fos是細胞基因組的一種原癌基因，在神經(jīng)元興奮后可以迅速并且短暫地表達FOS蛋白，因此也被稱為即刻早期基因（immediate early genes，IEGs）[1,2]。FOS蛋白被認作是細胞信號傳導(dǎo)途徑中的第三信使，可以促進許多與疼痛及鎮(zhèn)痛相關(guān)基因的表達[3]。FOS蛋白在神經(jīng)元受到多種刺激（尤其是傷害性刺激）后會迅速地表達，因此，被廣泛地認為是一種神經(jīng)元功能活化的標志[4]。

福爾馬林致痛模型是將5%福爾馬林注射到動物足底皮下，觀察注射后1h內(nèi)的自發(fā)痛反應(yīng)，是一種常用的炎性痛模型。既往已有大量的文獻報道，傳遞傷害性疼痛刺激的初級中樞脊髓背角在足底注射福爾馬林2h后會有大量的FOS蛋白表達[5-7]。同時，大腦作為高級中樞，在未成年大鼠足底注射福爾馬林以及成年大鼠在給予足底電刺激后，其腦內(nèi)與感受疼痛刺激直接相關(guān)的核團也會有大量FOS蛋白的表達[8,9]。但疼痛所帶來的不僅是一種傷害性的刺激，還會伴隨著機體的應(yīng)激和發(fā)生情緒的改變（如恐懼），同時機體也會對刺激做出相應(yīng)的防御性反應(yīng)等[8,10]。在疼痛刺激后腦內(nèi)與這些應(yīng)激、情緒、學習、記憶及產(chǎn)生防御反應(yīng)的核團是否也會活化，并表達FOS蛋白呢？足底注射福爾馬林后成年小鼠腦內(nèi)核團的活化情況是怎樣的？這些都需要去驗證和篩查。

老年人由于器官的退行性改變、損傷及腫瘤等原因而常常伴隨著疼痛的發(fā)生。因老年人的耐受性較強，往往能夠忍受疼痛而忽視治療，長時間的疼痛會使人產(chǎn)生情緒及性格的改變，如出現(xiàn)睡眠紊亂、食欲缺乏，導(dǎo)致焦慮、抑郁、精神崩潰，甚至人格扭曲等，嚴重影響患者的心理、社會功能，致使不少患者因無法長期忍受而選擇自殺。故通過本研究希望發(fā)現(xiàn)疼痛導(dǎo)致這些嚴重后果的解剖基礎(chǔ)，為今后臨床探尋更好的治療方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性C57BL/6小鼠（購自第四軍醫(yī)大學實驗動物中心），8～10周齡，體質(zhì)量18～22g，飼養(yǎng)室溫度恒定22℃±2℃并保證12h的光照，自由攝取食物和水。所有實驗在第四軍醫(yī)大學動物倫理委員會批準下進行。

1.2 福爾馬林痛模型

用微量注射器（Hamilton. NV，USA）30G的針頭，在小鼠右側(cè)后足趾側(cè)注射生理鹽水（生理鹽水組）或5%福爾馬林溶液（溶于生理鹽水）25μl（5%福爾馬林組）。注射后立即將小鼠置于透明的玻璃罩（25cm×25cm×40cm）中，通過視頻捕捉系統(tǒng)記錄注射福爾馬林溶液后60min內(nèi)小鼠的自發(fā)痛行為。經(jīng)過培訓的實驗者通過計數(shù)表和秒表分別統(tǒng)計小鼠回縮注射足的次數(shù)和舔/跤注射足的時間，用來評價小鼠疼痛的程度。

1.3 取材

福爾馬林溶液注射2h后，腹腔注射過量的戊巴比妥鈉（3%，0.1ml）將小鼠深麻醉后迅速開胸，先用50ml 0.9%的生理鹽水沖去體內(nèi)殘血，然后以含4%多聚甲醛的0.1mol/L PB（pH＝7.3）100ml灌注固定約1h。將脊髓腰5節(jié)段及大腦取出放于相同的固定液中后固定3h，隨后將組織置于30%的蔗糖溶液中4℃脫水。待組織沉底后取出，用恒冷箱切片機（Kryostat 1720；Leitz，Mannheim，Germany）將脊髓和大腦橫切，切片厚度為25μm，分別連續(xù)切片收集于3個孔中，每個孔中包含一套完整的切片。

1.4 免疫組織化學染色

每只小鼠取一套片子采用ABC法進行FOS染色，具體步驟：（1）用0.01mol/L PBS溶液漂洗3遍，每遍10min；（2）用含2%山羊血清和0.3%Triton X-100的0.01mol/L PBS溶液在常溫下封閉1h；（3）一抗Mouse-A-FOS（1∶500；Abcam，UK）加入含5%驢血清、0.3%TritonX-100、0.05%疊氮鈉和0.25%角叉菜膠的0.01mol/L PBS溶液，4℃孵育過夜；（4）二抗Bio-Goat-A-Mouse IgG （1∶200；Vector，Burlingame，CA，USA）加入含5%驢血清、0.3%TritonX-100、0.05%疊氮鈉和0.25%角叉菜膠的0.01mol/LPBS溶液，常溫下孵育4h；（5）Avidin-Biotin-peroxidase complex（ABC）Elite Kit （1∶100；Vector）加入0.01mol/L PBS溶液中，常溫下孵育1h；（6）最后將切片放入含0.04%二氨基聯(lián)苯胺（DAB）和0.003%雙氧水的0.05mol/L Tris-HCL中反應(yīng)至FOS顯色。上述的每一步間都需用0.01mol/L PBS溶液漂洗3遍，每遍10min。

陰性對照：從足底注射福爾馬林后的小鼠切片中取一套片子，按照上述步驟分別漂洗、封閉和加入抗體，但不加入一抗，最后采用ABC法進行顯色，觀察。

1.5 FOS蛋白表達陽性的神經(jīng)元計數(shù)

在Olympus光學顯微鏡下觀察小鼠脊髓背角及腦內(nèi)核團FOS蛋白的表達，并拍攝。由另外一名實驗人員計數(shù)各組小鼠脊髓背角和各個核團內(nèi)FOS蛋白陽性神經(jīng)元的數(shù)量，選取有能代表該核團的切片進行計數(shù)，每只小鼠至少計數(shù)5張切片，然后取平均值作為此只小鼠FOS蛋白陽性神經(jīng)元的平均數(shù)量。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 福爾馬林痛小鼠的自發(fā)痛行為及脊髓背角內(nèi)FOS蛋白的表達

C57BL/6小鼠右側(cè)后足足底皮下注射5%福爾馬林溶液后可以產(chǎn)生雙相自發(fā)痛反應(yīng)，包括自發(fā)的舔/咬注射足底和回縮注射足。無論是每5min內(nèi)舔/咬足時間還是縮足次數(shù)在前5min都達到高峰，后5min減弱，這就是第一個短暫的時相，持續(xù)10min；緊接著第二個時相從注射后10min開始，持續(xù)到約60min（圖1）。而足底注射生理鹽水的小鼠除注射引起的短暫疼痛外，無自發(fā)性痛行為的表現(xiàn)。

圖1 足底注射福爾馬林后1h內(nèi)的自發(fā)痛行為

Figure 1 Spontaneous pain behavior within 1 hour of formalin injection

C57BL/6小鼠足底注射福爾馬林2h后脊髓背角內(nèi)有大量FOS蛋白的表達。傷害性疼痛刺激的初級傳入中樞是脊髓的背角，足底注射福爾馬林后可以活化脊髓背角（spinal dorsal horn，SDH）內(nèi)的疼痛感受性神經(jīng)元，激活其基因組內(nèi)的c-fos基因表達FOS蛋白。FOS蛋白經(jīng)DAB顯色后為棕黃色的亮點，主要表達于細胞核內(nèi)。FOS蛋白陽性的神經(jīng)元不僅分布于脊髓背角的淺層，同時也存在于深層。而足底注射生理鹽水組小鼠脊髓背角內(nèi)表達FOS蛋白陽性的神經(jīng)元的數(shù)量相對較少（＜0.01；圖2）

2.2 足底注射福爾馬林2h后腦內(nèi)核團FOS蛋白的分布

高倍鏡下FOS蛋白陽性的神經(jīng)元中，棕黃色著色即為神經(jīng)元細胞核，胞質(zhì)未見著色。足底注射福爾馬林后在腦內(nèi)許多核團可以看到明顯增多的FOS陽性神經(jīng)元。在丘腦中間背側(cè)核（medial dorsal thalamic nucleus，MDTN）、下丘腦的室旁核（paraventricular nucleus，PVN）和背側(cè)區(qū)、島葉（insular cortex，IC）、前扣帶回皮質(zhì)（anterior cingulate cortex，ACC）及杏仁核（amygdala）海馬的CA1區(qū)和齒狀回（dentate gyrus，DG）都可見到FOS蛋白的表達增多（表1）。

足底注射生理鹽水后在MDTN及下丘腦的PVN處可見到少量的FOS陽性神經(jīng)元，胞核為棕黃色，胞質(zhì)陰性，染色淺，散在分布。注射福爾馬林溶液2h后FOS蛋白表達明顯增多（＜0.01），F(xiàn)OS陽性神經(jīng)元密集分布于整個核團（圖3）。

足底注射生理鹽水后在ACC、IC和杏仁核處均可見到少量的FOS陽性神經(jīng)元散在分布，注射福爾馬林溶液2h后FOS蛋白表達明顯增多（＜0.01），ACC和杏仁核中FOS陽性神經(jīng)元密集分布于整個核團，IC內(nèi)FOS陽性神經(jīng)元分布密度也較高（圖4）。

足底注射生理鹽水在海馬內(nèi)CA1區(qū)和DG區(qū)偶見FOS陽性神經(jīng)元散在分布，染色較淺，注射福爾馬林溶液2h后CA1區(qū)內(nèi)FOS陽性神經(jīng)元仍散在分布，與生理鹽水組差異無統(tǒng)計學意義（＞0.05），而DG區(qū)內(nèi)的FOS陽性神經(jīng)元有一定程度的增加（＜0.05），仍是散在分布（圖5）。

表1 脊髓背角及各腦區(qū)內(nèi)FOS陽性神經(jīng)元的數(shù)量

SDH: 脊髓背角; PVN: 下丘腦的室旁核; MDTN: 丘腦中間背側(cè)核; ACC: 前扣帶回皮質(zhì); Amygdala: 杏仁核; IC: 島葉; DG: 齒狀回。與生理鹽水組比較,P＜0.05,P＜0.01

3 討 論

本研究通過免疫組織化學的方法探討了在C57BL/6小鼠足底注射5%福爾馬林溶液后，神經(jīng)元活化的標志物FOS蛋白在SDH及大腦核團內(nèi)的表達情況。結(jié)果顯示，足底注射福爾馬林后可以引起明顯的雙相自發(fā)痛行為，在注射2h后SDH內(nèi)FOS陽性神經(jīng)元明顯增加，在丘腦、下丘腦、杏仁核、ACC及IC都有大量FOS蛋白的表達，而海馬CA1區(qū)和DG區(qū)的FOS陽性神經(jīng)元增加不明顯。

圖2 足底注射福爾馬林2h后同側(cè)脊髓背角內(nèi)FOS蛋白的表達

Figure 2 Expression of FOS protein in ipsilateral SDH after 2 hours of formalin injection (scale bar＝50μm)

A: 陰性對照組; B: 生理鹽水組; C: 5%福爾馬林組

圖3 足底注射福爾馬林2h后丘腦和下丘腦核團內(nèi)FOS蛋白的表達

Figure 3 Expression of FOS protein in nucleus of thalamus and hypothalamus after 2 hours of formalin injection

A, B, A', B': 生理鹽水組; A'', B'': 5%福爾馬林組。MDTN: 丘腦中間背側(cè)核, PVN: 下丘腦室旁核

圖4 足底注射福爾馬林2h后前扣帶回和島葉皮質(zhì)及杏仁核內(nèi)FOS蛋白的表達

Figure 4 Expression of FOS protein in ACC and Amygdala after 2 hours of formalin injection

A, B, C, A’, B’, C’; 生理鹽水組; A”, B”, C”: 5%福爾馬林組。ACC: 前扣帶回皮質(zhì); IC: 島葉皮質(zhì); Amygdala: 杏仁核

福爾馬林痛模型是常用的急性炎性痛模型。足底注射福爾馬林引起的雙相自發(fā)痛行為中，第一相被認為是由直接的機械性組織損傷引起的急性痛行為，而第二相則是由注射入的福爾馬林引起的炎癥反應(yīng)所導(dǎo)致的持續(xù)性痛行為。而第二相的行為表現(xiàn)與炎性疼痛刺激的強度呈正相關(guān)。

機體細胞在受到多種傷害性因素（如物理刺激、化學刺激等）的刺激后可誘導(dǎo)胞核內(nèi)原癌基因c-fos表達FOS蛋白。在正常情況下，細胞內(nèi)c-fos很少表達，疼痛刺激可以激活SDH內(nèi)與感受痛覺相關(guān)的神經(jīng)元的c-fos并表達FOS蛋白。當細胞受到刺激后，細胞核內(nèi)基因組轉(zhuǎn)錄的c-fos mRNA轉(zhuǎn)移到胞質(zhì)，由核糖體翻譯為FOS蛋白，F(xiàn)OS蛋白與Jun蛋白合成二聚體，在AP-1的介導(dǎo)下易位到細胞核內(nèi)調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄。在一定程度上，F(xiàn)OS陽性神經(jīng)元的數(shù)量與所受的刺激強度成正比。c-fos基因是一種“即刻表達基因”，F(xiàn)OS蛋白在受到刺激1h后就可有明顯的反應(yīng)。已有文獻報道，小鼠足底皮下注射福爾馬林后2h同側(cè)SDH FOS蛋白表達達到最高峰[11]。因此，筆者選擇在足底注射福爾馬林2h后來觀察SDH及大腦各區(qū)域內(nèi)FOS蛋白表達的數(shù)量。Roussy等[12]報道足底注射福爾馬林后在SDH的淺層和深層都有FOS蛋白的表達，包括Ⅰ～Ⅵ層的神經(jīng)元和Ⅹ層的神經(jīng)元。但主要還是集中在SDH的Ⅰ層和Ⅱ?qū)拥耐鈧?cè)。

圖5 足底注射福爾馬林2h后海馬內(nèi)FOS蛋白的表達

Figure 5 Expression of FOS protein in hippocamus after 2 hours of formalin injection

A, B, A’, B’: 生理鹽水組; A”, B”: 5%福爾馬林組

受到傷害性刺激后，脊髓上位中樞特別是腦內(nèi)神經(jīng)核團的活化也有許多的研究。在大鼠內(nèi)臟痛模型中，無論是因彌漫性腹膜炎，亦或是較局限的膀胱炎癥所引發(fā)的內(nèi)臟痛，在其延髓腹外側(cè)區(qū)、臂旁核、中縫背核、中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)、杏仁核、皮層、丘腦和下丘腦的許多核團都可以發(fā)現(xiàn)FOS陽性的神經(jīng)元[13]。內(nèi)臟痛與軀體痛在脊髓中的初級中樞雖然不同，但是在腦內(nèi)應(yīng)該有許多相同的高位中樞可以對疼痛刺激做出反應(yīng)。

PVN和MDTN核被認為與面對危險或刺激時自主反應(yīng)的形成相關(guān)[8]。足底注射福爾馬林后，活化的不僅是與感受疼痛相關(guān)的大腦區(qū)域。小鼠在受到應(yīng)激后也會做出相應(yīng)的本能反應(yīng)，因此與這種防御反應(yīng)相關(guān)的PVN和MDTN中也有大量的FOS蛋白表達。

大量的研究證明ACC與疼痛、記憶及情緒有密切的關(guān)系[14]。PET檢查顯示，傷害性刺激和與疼痛相關(guān)的不愉快的事件都可引起大腦內(nèi)ACC、杏仁核及IC的活化[15,16]。臨床上，手術(shù)損毀ACC及其附近的皮層可以顯著地降低患者因疼痛引起的煩躁不安[17]。同時，大量的神經(jīng)影像學方法研究了在抑郁和疼痛時不同腦區(qū)的活化和改變，發(fā)現(xiàn)疼痛時IC和ACC都有明顯的活化，IC、ACC、感覺皮質(zhì)和前額葉皮質(zhì)被稱為“the pain matrix”[18,19]。一項薈萃分析顯示IC參與了抑郁癥時對情緒刺激的反應(yīng)[20]。也有實驗證明杏仁核參與條件性恐懼及疼痛的過程[21,22]。因此在足底注射福爾馬林后，產(chǎn)生的疼痛刺激以及恐懼情緒等都可活化ACC、IC、杏仁核內(nèi)的神經(jīng)元使其表達FOS蛋白。

海馬的功能主要與學習記憶的形成及情緒的形成相關(guān)。足底注射福爾馬林作為一種急性的疼痛刺激，引起的海馬神經(jīng)元活化相對于其他核團較少。Ceccarelli等[23]曾經(jīng)比較了大鼠足底注射福爾馬林2h后CA1區(qū)和DG區(qū)在雌性和雄性間的區(qū)別。注射福爾馬林2h后，在CA1區(qū)雌性大鼠的FOS陽性神經(jīng)元的數(shù)量少于對照組而雄性與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義；同樣，在DG區(qū)雌性大鼠與對照組比較，F(xiàn)OS陽性神經(jīng)元的數(shù)量無明顯差異，而雄性大鼠FOS蛋白的表達要多于對照組，與本實驗中所觀察到的基本相符。但是持續(xù)的慢性疼痛刺激是否會大量地活化海馬內(nèi)神經(jīng)元，還有待后續(xù)的慢性疼痛實驗來確認。

疼痛刺激不僅活化了脊髓和腦內(nèi)與感受痛覺相關(guān)的核團，而且也活化了與應(yīng)激、情緒、學習、記憶及產(chǎn)生防御反應(yīng)相關(guān)的PVN、MDTN、ACC、IC、杏仁核和海馬的DG區(qū)。本研究為疼痛引起情緒、性格改變，影響學習記憶的機制研究提供了形態(tài)學的證據(jù)。為今后在臨床工作中對老年人特別是有多器官疾病耐受疼痛的老年人及時治療疼痛，解除疼痛提供了強有力的理論依據(jù)。

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（編輯: 王雪萍）

FOS expression in supraspinal regions after formalin-induced pain in mice

YIN Jun-Bin1, ZHANG Ting1, ZHOU Ke-Cheng2, WANG Li-Ying1, XIA Liang3, Hu Wei1, WANG Wen1*

(1Department of Human Anatomy, Histology and Embryology, K.K. Leung Brain Research Centre, Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, China;2Department of Complex Prescription of TCM, China Pharmaceutical University, Nanjing 211198, China;3Department of Psychology, Institute of Aerospace Medicine, Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, China)

To investigate the expression profiles of FOS protein in the mice brain subregions induced by subcutaneous formalin injection to one hindpaw.After adult mice received an injection of 5% formalin in the hindpaw, their spontaneous pain behaviors were recorded within 60min. The expression, distribution and number of FOS-positive neurons in the ipsilateral dorsal horn and supraspinal regions were detected by immunohistochemical assay at two hours after formalin injection.These mice showed their biting/licking time and flinches in a typical two-phase manner within 60min. The immunohistochemical staining results showed that FOS-positive neurons were significantly increased in the ipsilateral spinal cord, paraventricular nucleus, medial dorsal thalamic nucleus, anterior cingulate cortex, insular cortex and amygdala. Meanwhile, the expression of FOS protein in the dentate gyrus of hippocampus was also slightly increased.Not only spinal dorsal horn but also subregions sensitive to pain and stress, will be activated functionally to mediate defensive response when mice are exposed to nociceptive stimuli.

c-fos; FOS protein; formalin-induced pain; immunohistochemical staining; nucleus of brain.

(31070976).

R741.02

A

10.3724/SP.J.1264.2013.00112

2012-12-19;

2013-03-20

國家自然科學基金（31070976）

張婷, 為共同第一作者

王 文, Tel: 029-84774504, E-mail: wangwen@fmmu.edu.cn