王艷艷，鄧啟華

（北京燕京啤酒股份有限公司技術(shù)中心，北京 101300）

納豆激酶（Nattokinase）是1987年由日本學者從納豆中提取的一種絲氨酸蛋白酶，該酶不僅具有明顯的溶栓能力，還可以激活體內(nèi)的纖溶酶原，從而增加內(nèi)源性纖溶酶的量與作用[1-3]。目前臨床上使用的治療心腦血管栓塞的藥品如尿激酶（urokinase，UK），鏈激酶（streptokinase，SK），組織型纖溶酶原激活物（tissue-type plasminogenactivator，tpA）等均在不同程度上存在一定的缺陷（毒性較強，副作用較大；體內(nèi)半衰期短，難以發(fā)揮藥效；來源緊缺，價格昂貴），而納豆激酶有望彌補這些缺陷，成為新一代的溶栓藥物[4-8]。納豆激酶是納豆芽孢桿菌（Bacillus subtilisNatto）的代謝產(chǎn)物，納豆激酶的生產(chǎn)普遍采用固體發(fā)酵大豆制備納豆，然后從納豆中分離純化的方法得到，而在固體發(fā)酵過程中染菌，散熱問題一直未能得到很好的解決[9-10]。相對而言，納豆激酶液體發(fā)酵生產(chǎn)工藝簡單，成本低廉，因此進行納豆激酶液體發(fā)酵工藝的研究是非常有必要的，而對納豆激酶液體發(fā)酵條件進行全面優(yōu)化是這一研究工作的關(guān)鍵所在。

本實驗對納豆激酶的液體發(fā)酵條件進行了系統(tǒng)研究，通過正交試驗確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)基，并運用響應面分析法對發(fā)酵條件進行了優(yōu)化，利用Box-Benhnken的中心組合試驗設計，對試驗數(shù)據(jù)進行響應面分析[11-12]，并對擬合數(shù)學模型進行了較為詳細的描述，最終對納豆激酶液體發(fā)酵工藝進行了優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

納豆芽孢桿菌來自于燕京中發(fā)生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 試劑

蚓激酶：中國藥品生物制品檢定所；凝血酶、纖維蛋白原：中國食品藥品檢定研究院；瓊脂糖、葡萄糖、木糖、玉米淀粉、大豆蛋白胨、動物蛋白胨、KH2PO4、K2HPO4、CaCl2及MgSO4·7H2O等均為國產(chǎn)試劑。

1.1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：平板計數(shù)培養(yǎng)基。

種子培養(yǎng)基：營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基。

基礎培養(yǎng)基：葡萄糖2%，大豆蛋白胨4%，KH2PO40.1%，K2HPO40.1%，CaCl20.02%，MgSO4·7H2O 0.05%，pH 7.0～7.2。

培養(yǎng)條件：從斜面上挑取一環(huán)菌苔接入種子培養(yǎng)基中，37℃、150r/min振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期，隨后將種子液按一定比例接種于裝有100mL培養(yǎng)基的500mL錐形瓶中，培養(yǎng)48h結(jié)束后離心取上清液測定酶活。

1.2 儀器與設備

ZHWY-111C型恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智誠分析儀器制造有限公司；5804R型離心機：德國Eppendorf公司；LDZH-150KBS立式壓力滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；SPECORD205型紫外可見分光光度計：德國Anylytikjena公司；8417型pH計：意大利Hanna公司；BX-240H電子天平：日本島津公司；LRH-250生化培養(yǎng)箱：日本SANYO公司。

1.3 方法

1.3.1 繪制納豆芽孢桿菌的生長曲線

將培養(yǎng)好的種子液接入基礎培養(yǎng)基中，37℃、150r/min振蕩培養(yǎng)，每隔2h取樣，以未接種的培養(yǎng)基為空白，測波長600nm處的吸光度值（OD600nm），繪制納豆芽孢桿菌的生長曲線，根據(jù)納豆芽孢桿菌的對數(shù)生長期確定最適種齡。

1.3.2 發(fā)酵培養(yǎng)基配方的優(yōu)化

發(fā)酵培養(yǎng)基的碳氮源及碳氮比優(yōu)化：通過單因素試驗對基礎培養(yǎng)基的碳、氮源及碳氮比進行了初步研究，確定出產(chǎn)酶量比較高的3種碳源、氮源及碳氮比。在此基礎上采用L9（34）正交試驗法對碳源、氮源及碳氮比3個影響因素進一步研究，最終確定出發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳碳氮源配方。

發(fā)酵培養(yǎng)基的無機鹽濃度優(yōu)化：采用L9（34）正交試驗對基礎培養(yǎng)基的無機鹽（MgSO4，CaCl2及K2HPO4/KH2PO4）的濃度進行優(yōu)化，確定出發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳無機鹽組成。

1.3.3 響應面分析法確定最佳液體發(fā)酵條件

以優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)納豆芽孢桿菌，通過單因素試驗對發(fā)酵的條件（接種量，裝液量，發(fā)酵溫度，初始pH值）進行初步分析，隨后依據(jù)Box-Benhnken試驗設計對發(fā)酵條件進行3因素3水平的響應面分析試驗，包括12個析因試驗和3個中心試驗。利用統(tǒng)計軟件Minitab15[13-14]對試驗數(shù)據(jù)進行分析，確定出最佳發(fā)酵條件。

1.3.4 納豆激酶活力測定

納豆激酶的酶活采用瓊脂糖纖維蛋白平板法[15]進行測定，以蚓激酶作酶活的標準曲線。

1.3.5 酶活定義酶活定義為：在37℃，pH 7.8的條件下，1min內(nèi)溶解1μmol纖維蛋白所需的酶量為1U。

2 結(jié)果與分析

2.1 納豆芽孢桿菌的生長曲線

從發(fā)酵開始連續(xù)測定OD值大約30h，最終得到的納豆芽孢桿菌的生長曲線見圖1。

由圖1可知，納豆芽孢桿菌在0～6h時為停滯期，6h后開始進入對數(shù)期，大約至24h時對數(shù)期結(jié)束。由于納豆芽孢桿菌在對數(shù)生長期時菌體生命力極為旺盛，此時將種子液進行轉(zhuǎn)接既可以避免生長緩慢、發(fā)酵周期過長，又不會導致菌體過早自溶，因此可以確定納豆芽孢桿菌在種子液中培養(yǎng)18h～20h后接入發(fā)酵培養(yǎng)基中最為適宜，選取18h～20h作為納豆芽孢桿菌的種齡。

圖1 納豆芽孢桿菌的生長曲線Fig.1 The growth curve ofBacillus subtilis Natto

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基的確定

2.2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳碳氮源及碳氮比確定

通過前期的單因素試驗確定出相對產(chǎn)酶量比較高的碳源為玉米淀粉、葡萄糖、木糖；比較適宜的氮源為大豆蛋白胨、動物蛋白胨及大豆粉；碳氮比確定為4%/2%、4%/4%、2%/4%。采用正交試驗對發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源、氮源及碳氮比進行了優(yōu)化。正交試驗因素水平見表1，試驗結(jié)果見表2。

表1 發(fā)酵培養(yǎng)基碳氮源配方正交試驗因素水平Table 1 Factors and levels of the orthogonal test for the optimization of carbon and nitrogen formula in the medium

表2 發(fā)酵培養(yǎng)基碳氮源配方正交試驗結(jié)果Table 2 Results of the orthogonal test for the optimization of carbon and nitrogen formula in the medium

由表2可知，3個因素對產(chǎn)酶影響的順序為A＞B＞C。由k值得到的最佳配比為玉米淀粉2%，動物蛋白胨4%；從表2結(jié)果來看，酶活最高的配比為玉米淀粉4%，動物蛋白胨4%。

對這2種碳氮源配比進行發(fā)酵驗證試驗，試驗結(jié)果見表3。

表3 發(fā)酵培養(yǎng)基碳氮比配方正交試驗驗證試驗Table 3 Verification test of the orthogonal test for the optimization of carbon and nitrogen formula in the medium

由表3可知，通過驗證試驗確定最佳碳氮源配比為玉米淀粉2%，動物蛋白胨4%。

2.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基的無機鹽濃度確定

微生物在生長繁殖和生產(chǎn)過程中，需要某些無機鹽和礦物質(zhì)元素作為其生理活性物質(zhì)的組成或生理活性作用的調(diào)節(jié)物。這些物質(zhì)一般在低濃度時對微生物生長和產(chǎn)物合成有促進作用，在高濃度時常表現(xiàn)出明顯的抑制作用。因此選擇合適的無機離子濃度是非常重要的。在眾多無機離子中，鉀、鈣、鎂等陽離子是許多酶的激活劑，影響蛋白質(zhì)的合成。通過正交試驗研究了MgSO4·7H2O，CaCl2及K2HPO4/KH2PO4對產(chǎn)酶的影響，因素水平見表4，試驗結(jié)果見表5。

表4 發(fā)酵培養(yǎng)基無機鹽濃度正交試驗因素水平Table 4 Factors and levels of the orthogonal test for the optimization of medium inorganic concentration

表5 發(fā)酵培養(yǎng)基無機鹽濃度正交試驗結(jié)果Table 5 Results of the orthogonal test for the optimization of medium inorganic concentration

由表5可知，CaCl2對產(chǎn)酶有明顯的促進作用。通過k值得到無機鹽的最佳濃度為MgSO4·7H2O 0.05%，CaCl20.01%，K2HPO4/KH2PO40.1%/0.1%。由正交試驗直觀分析結(jié)果可知，產(chǎn)酶最高的無機鹽濃度為MgSO4·7H2O 0.05%，CaCl20.01%，K2HPO4/KH2PO40.3%/0.1%。對所得結(jié)論進行驗證試驗，試驗結(jié)果見表6。

表6 發(fā)酵培養(yǎng)基無機鹽濃度的驗證試驗Table 6 Verification test of the medium inorganic salt concentration

由表6的酶活結(jié)果來看，最佳的無機鹽濃度為MgSO4·7H2O 0.05%，CaCl20.01%，K2HPO4/KH2PO40.3%/0.1%。

通過正交試驗確定了納豆激酶液體發(fā)酵的最佳培養(yǎng)基為玉米淀粉2%，動物蛋白胨4%，MgSO4·7H2O 0.05%，CaCl20.01%，K2HPO4/KH2PO4為0.3%/0.1%。

2.3 響應面分析法確定最佳液體發(fā)酵條件

以優(yōu)化后的培養(yǎng)基液體發(fā)酵納豆芽孢桿菌，通過單因素試驗考察了接種量、裝液量、發(fā)酵溫度、初始pH值對產(chǎn)酶的影響。由單因素試驗結(jié)果可知，最佳裝液量為50mL/500mL錐形瓶。接種量、發(fā)酵溫度、初始pH值對產(chǎn)酶影響顯著。

根據(jù)Box-Benhnken的中心組合試驗設計原理，并結(jié)合單因素試驗結(jié)果，進行3因素3水平的響應面分析試驗。因素水平見表7。

表7 響應面試驗因素與水平Table 7 Factors and levels of the response surface test

以接種量（A）、發(fā)酵溫度（B）、初始pH值（C）為自變量，以培養(yǎng)48h后測得納豆激酶酶活為響應值（Y），進行響應面分析，試驗方案及結(jié)果見表8。

利用Minitab15對試驗數(shù)據(jù)進行二次多項回歸擬合，建立二次響應面回歸模型，優(yōu)化各因素水平。具體的分析結(jié)果見表9、表10。

由表9可知，B的線性項，A、B、C的平方項對納豆激酶酶活具有顯著作用。另外，B與C的交互作用也是比較顯著的。該模型的決定系數(shù)R2=0.912，說明回歸方程的擬合程度較好。根據(jù)表9得到納豆激酶酶活（Y）對接種量、發(fā)酵溫度、初始pH值的二次回歸方程式：

表8 響應面分析方案及試驗結(jié)果Table 8 Scheme and results of the response surface test

表9 納豆激酶酶活的估計回歸系數(shù)Table 9 Estimated regression coefficient of Natto kinase activity

表10 納豆激酶酶活的估計回歸系數(shù)表的方差分析Table 10 Variance analysis of estimated regression coefficient of Nattokinase activity

由表10可知，該模型的p值為0.003，小于0.01，說明該模型的回歸顯著。失擬的p值為0.072，大于0.05，這說明該模型的失擬不顯著。

利用Minitab15所生成的響應曲面分析圖見圖2～圖4。

圖2 納豆激酶酶活與發(fā)酵溫度，接種量的曲面圖及等值線圖Fig.2 Response surface and contour plot of natto kinase activity,fermentation temperature,and inoculation size

圖3 納豆激酶酶活與初始pH值，接種量的曲面圖及等值線圖Fig.3 Response surface and contour plot of natto kinase activity,initial pH and inoculation size

圖2～圖4表明，當某一因素達到最佳水平時，其他2個獨立因素之間的相互作用。從3個響應面曲面圖看出，發(fā)酵溫度對納豆激酶酶活的影響比較顯著。由相應的等高線圖可知，發(fā)酵溫度與接種量、初始pH值與接種量的等高線圖接近圓形，交互作用不顯著，而發(fā)酵溫度與初始pH值的等高線圖呈橢圓形，交互作用顯著。

圖4 納豆激酶酶活與初始pH值，發(fā)酵溫度的曲面圖及等值線圖Fig.4 Response surface and contour plot of natto kinase activity,initial pH and fermentation temperature

由Minitab15對回歸方程進行分析得到優(yōu)化后的條件：接種量3.14%，發(fā)酵溫度36.05℃，初始pH值為6.83。為方便操作，優(yōu)化后的條件改為接種量3.1%，發(fā)酵溫度36℃，初始pH值為6.8。納豆激酶酶活的最大估計值為32.22kU/mL。在所得的優(yōu)化條件下進行3次驗證試驗，所得的納豆激酶酶活分別為31.32kU/mL、33.25kU/mL、33.61kU/mL，平均值為32.73kU/mL，實驗值與理論預測值非常接近，這說明該模型可以較好地預測實際發(fā)酵情況，并證明了利用響應面優(yōu)化納豆激酶液體發(fā)酵條件的可行性。

3 結(jié)論

本實驗利用正交試驗法和響應面分析法對納豆激酶液體發(fā)酵條件進行了系統(tǒng)研究。通過監(jiān)測納豆芽孢桿菌的生長曲線確定出18h～20h為最適種齡。利用正交試驗對培養(yǎng)基組成進行了優(yōu)化，確定出發(fā)酵的最佳培養(yǎng)基為玉米淀粉2%，動物蛋白胨4%，MgSO4·7H2O 0.05%，CaCl20.01%，K2HPO4/KH2PO40.3%/0.1%。隨后由響應面分析法對納豆激酶液體發(fā)酵條件進行了優(yōu)化，根據(jù)Box-Benhnken試驗設計建立了發(fā)酵條件的二次多項數(shù)學模型，并利用Minitab15軟件對模型進行了顯著性檢驗，得到了優(yōu)化后的發(fā)酵條件：初始pH值為6.8，裝液量50mL/500mL錐形瓶，接種量3.1%，發(fā)酵溫度36℃。經(jīng)過優(yōu)化，發(fā)酵48h后的納豆激酶酶活從12.47kU/mL提高為32.73kU/mL。

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