左 松，伍時(shí)華，張 健，趙東玲*，黃翠姬

（廣西科技大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西 柳州 545006）

甘蔗汁營(yíng)養(yǎng)成分豐富，其中的蔗糖、果糖及葡萄糖含量達(dá)12%～16%。甘蔗汁主要用于生產(chǎn)白糖，但在能源危機(jī)的影響下，巴西、印度和泰國(guó)等國(guó)已大規(guī)模利用甘蔗汁進(jìn)行乙醇生產(chǎn)[1]。

酵母是生產(chǎn)乙醇的最主要微生物，利用酵母進(jìn)行甘蔗汁酒精發(fā)酵在諸多文獻(xiàn)中都有報(bào)道，主要集中在甘蔗原汁酒精發(fā)酵[2-3]和甘蔗汁糖濃度調(diào)整后酒精發(fā)酵等方面[4-10]，而其過程中果糖與葡萄糖代謝受外部因素影響的研究未得到足夠的重視。甘蔗汁主要含糖為蔗糖，發(fā)酵過程中，蔗糖水解為等摩爾的果糖和葡萄糖，果糖和葡萄糖共用一套膜運(yùn)輸和酶催化體系[11]，但果糖對(duì)膜運(yùn)輸和酶的親和力均小于葡萄糖，因而酵母往往偏向利用葡萄糖，使得果糖成為發(fā)酵后期主要?dú)執(zhí)恰５@一現(xiàn)象并不固定，果糖和葡萄糖的利用易受溫度、可同化氮源和糖濃度等因素的影響[12-13]。TRONCHONI J等[14]研究表明，在12℃和28℃條件下，果糖和葡萄糖利用受溫度影響較大，低溫時(shí)，某些釀酒酵母發(fā)酵初期甚至?xí)霉?。BERTHELS NJ等[15]利用葡萄汁發(fā)酵時(shí)，添加氮源后促進(jìn)葡萄糖消耗達(dá)6%～9%，而促進(jìn)果糖消耗達(dá)13%～17%，這一現(xiàn)象也得到MESSIAS JM等[16]的證實(shí)，說明果糖與葡萄糖利用的差異性因氮源的加入而得到了縮小。在高糖濃度發(fā)酵時(shí)，氮源的利用量會(huì)有所降低[17]，因而可能會(huì)更加不利于果糖的代謝。目前，糖濃度對(duì)酒精酵母發(fā)酵過程中果糖和葡萄糖利用差異性影響的研究較少，因此有必要進(jìn)行探索。

為了避免蔗糖水解和氮源補(bǔ)加不當(dāng)對(duì)研究的影響，以酵母浸出粉胨葡萄糖果糖（yeast extract peptone dextrose fructose，YPDF）培養(yǎng)基模擬甘蔗汁進(jìn)行酵母GJ2008等濃度果糖與葡萄糖混合發(fā)酵，研究過程中果糖與葡萄糖利用及其差異性受糖濃度的影響，從而為甘蔗汁酒精發(fā)酵工業(yè)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

酒精酵母GJ2008（Saccharomyces cerevisiae）：由廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院發(fā)酵工程研究所保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面活化培養(yǎng)基：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母浸膏10g/L，瓊脂20g/L，自然pH值，115℃蒸汽滅菌30min。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母浸膏10g/L，pH 4.5，115℃蒸汽滅菌30min。

YPDF培養(yǎng)基：蛋白胨20g/L，酵母浸膏10g/L，pH 4.5，115℃蒸汽滅菌30min，無菌添加等比例果糖和葡萄糖調(diào)節(jié)總糖約為90g/L、230g/L、250g/L和270g/L。

1.1.3 試劑

葡萄糖（分析純）、硫酸（分析純）：西隴化工股份有限公司；果糖（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司；乙腈（色譜純）：安徽時(shí)聯(lián)特種溶劑股份有限公司；酵母浸膏、蛋白胨：廣東環(huán)凱微生物科技公司；乙醇（色譜純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

D-2000高效液相色譜儀：日立（中國(guó)）有限公司；Vennsil-AA氨基色譜柱：天津博納艾杰科技有限公司；SBA-40C生物傳感分析儀：山東省科學(xué)院生物研究所；UPHW優(yōu)普系列超純水機(jī)：上海優(yōu)普實(shí)業(yè)有限公司；HWY-2112 全溫度恒溫調(diào)速搖床柜：上海智城分析儀器制造有限公司；1110MIKRO 22R臺(tái)式冷凍離心機(jī)：德國(guó)Hettich公司；DMB5 Motic數(shù)碼顯微鏡：麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司；K5500微量分光光度計(jì)：北京凱奧科技發(fā)展有限公司；K5500微量分光光度計(jì)：上海澤仕光電科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 發(fā)酵方法

將實(shí)驗(yàn)室保存菌種接至斜面活化培養(yǎng)基上，30℃條件下活化培養(yǎng)1d～2d，待其斜面上長(zhǎng)出白色菌落，即菌種培養(yǎng)成熟。將已活化的酵母斜面種子轉(zhuǎn)接至250mL種子培養(yǎng)基中（500mL錐形瓶），搖床120r/min，溫度32℃，培養(yǎng)12h后離心棄上清液，無菌水洗2次（去掉殘余糖），再用無菌水稀釋酵母泥至合適體積并振蕩均勻。

以接種量10%將種子液轉(zhuǎn)接至200mL YPDF發(fā)酵培養(yǎng)基中（500mL錐形瓶），初始酵母數(shù)為1×107個(gè)/mL左右，搖床120r/min培養(yǎng)，每份3個(gè)平行，測(cè)定結(jié)果取平均值。發(fā)酵過程中每隔4h或6h取樣并測(cè)CO2失重，至CO2失重小于0.2g時(shí)，即發(fā)酵結(jié)束。

1.3.2 分析方法

高效液相色譜法測(cè)定果糖和葡萄糖濃度，其色譜條件為流動(dòng)相為色譜純乙腈/二次蒸餾水=80∶20，流速1mL/min，柱溫30℃；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（evaporative light scattering detector，ELSD）參數(shù)為漂移管溫度95℃，空氣流速2.0L/min。OD560nm值的測(cè)定：取發(fā)酵液1mL，12000r/min離心2min，取上清液-60℃冷凍（用以測(cè)糖濃度和酒精度），無菌水洗滌濕酵母泥離心棄上清液2次，加入1mL無菌水，振蕩充分后測(cè)定OD560nm值；采用血球計(jì)數(shù)板法進(jìn)行計(jì)數(shù)，作出OD560nm值與酵母數(shù)（108個(gè)/mL）對(duì)應(yīng)曲線，y=0.7756x-0.1175（y代表酵母數(shù)，x代表OD560nm值），R2=0.9818；酒精度采用生物傳感分析儀測(cè)定。

1.3.3 糖代謝曲線擬合

運(yùn)用Origin 8.0軟件對(duì)果糖和葡萄糖的代謝過程進(jìn)行非線性曲線擬合，糖代謝擬合方程較好的主要為伯爾茲曼S形函數(shù)和邏輯斯蒂S形函數(shù)，選擇函數(shù)R2最大作為擬合方程，以擬合方程分別計(jì)算果糖與葡萄糖消耗一半和消耗完全的時(shí)間，記做tF50、tG50和tFend、tGend。

2 結(jié)果和討論

2.1 糖濃度對(duì)糖代謝的影響

不同糖濃度下，酵母GJ2008在培養(yǎng)基含有等量的果糖和葡萄糖時(shí)，均對(duì)葡萄糖優(yōu)先利用，隨著總糖濃度的提高，酵母的活力受到抑制，果糖和葡萄糖的轉(zhuǎn)化速率均有所減慢，兩糖消耗曲線逐漸拉開。對(duì)總糖90g/L（圖1A）而言，發(fā)酵至8h，葡萄糖已經(jīng)消耗殆盡，果糖后期利用速率受其影響程度最??；對(duì)總糖230g/L（圖1B）而言，12h～18h發(fā)酵時(shí)間段，葡萄糖利用稍微減慢，而果糖利用則有所減慢而后又急劇加快，可以解釋為酵母在一定時(shí)間內(nèi)合成的糖膜運(yùn)輸?shù)鞍椎牧渴且欢ǖ模呛推咸烟枪灿靡惶啄み\(yùn)輸體系[11]，葡萄糖含量較低時(shí)，果糖受葡萄糖的膜競(jìng)爭(zhēng)性抑制得到了解除（單糖發(fā)酵表明酵母GJ2008果糖和葡萄糖利用速率相當(dāng)），果糖的利用急劇加快；總糖250g/L（圖1C）與總糖230g/L（圖1B）相比，發(fā)酵至24h，該時(shí)間點(diǎn)生物量和乙醇生成量均幾乎是相同的，但24h～30h發(fā)酵時(shí)間內(nèi)，前者果糖的利用并沒有因葡萄糖含量低而急速加快，差別在于前者酵母細(xì)胞前期的生成量一直低于后者，因而可以排除乙醇的抑制作用是后期果糖利用緩慢的主要原因[11]，更可能是由于氮源的利用受到了高濃度糖的抑制[17]，不利于細(xì)胞的合成，從而影響了糖特別是果糖的利用?？偺?70g/L（圖1D）時(shí)，發(fā)酵后期果糖利用明顯停滯，葡萄糖雖然能利用完全，但消耗速率較為緩慢，表明總糖≥250g/L已經(jīng)不利于酵母GJ2008對(duì)果糖和葡萄糖的消耗。

在糖濃度為90g/L～270g/L，果糖和葡萄糖的代謝擬合曲線均為S型下降（見圖1A～1D）。所得到的擬合方程的R2在0.9955～1.0000之間，擬合程度較好，能夠有效地描述發(fā)酵過程中糖代謝的變化，糖代謝擬合方程見表1。由表1可知，糖濃度對(duì)酵母GJ2008果糖和葡萄糖代謝的擬合曲線類型影響并不大。

圖1 不同糖濃度下酵母GJ2008果糖與葡萄糖代謝過程曲線Fig.1 Profiles of fructose,glucose concentrations during the ethanol fermentation from YPDF media byS.cerevisiae GJ 2008 at different total sugar concentrations

表1 不同糖濃度下酵母GJ2008果糖與葡萄糖代謝擬合方程Table 1 Fitted equation of fructose and glucose metabolism from YPDF medium byS.cerevisiae GJ2008 at different sugar concentrations

2.2 糖濃度對(duì)糖利用時(shí)間的影響

果糖與葡萄糖消耗一半和消耗完全時(shí)間的獲得對(duì)發(fā)酵過程的預(yù)測(cè)比較重要，這些數(shù)據(jù)可直接從表1擬合方程計(jì)算獲得。不同糖濃度下果糖、葡萄糖的t50值和tend值見表2。由表2可知，糖濃度90g/L～270g/L，tG50和tGend總是小于tF50和tFend，很清楚地表明酵母GJ2008對(duì)葡萄糖有著輕微的偏好，證實(shí)了酒精酵母對(duì)葡萄糖的嗜好性。隨著總糖濃度的增加，tFend隨之提高，但至總糖250g/L，其值急劇變大，說明總糖在低于250g/L時(shí)，酵母可以較快地利用果糖。由表3可知，不同糖濃度下的tF50/tF50、tG50/tG50和tFend/tFend、tGend/tGend的高低表明了酵母利用果糖和葡萄糖受到糖濃度影響的程度，tF50/tF50和tFend/tFend均大于tG50/tG50和tGend/tGend，可以說明果糖的代謝更易受到糖濃度的影響，此結(jié)論與ZINNAI A等[18]研究相類似。

總的來說，糖濃度90g/L～270g/L，兩糖的消耗過程主要發(fā)生在對(duì)數(shù)期，糖濃度由90g/L提高至230g/L后，對(duì)數(shù)期延長(zhǎng)，最終糖利用時(shí)間增加了24.39h；糖濃度由230g/L提高至250g/L后，對(duì)數(shù)期基本不變，最終糖利用時(shí)間增加了7.69h；糖濃度由250g/L提高至270g/L后，對(duì)數(shù)期有所延長(zhǎng)，最終果糖不能利用完全。因此糖濃度的選擇不宜高于250g/L。

表2 不同糖濃度下兩糖t50值和tend值Table 2 Times (hours) to consume half (t50) and total (tend) of the initial concentration of glucose and fructose present in YPDF media according to different total sugar concentrations

表3 不同糖濃度下兩糖t50/t50值和tend/tend值Table 3 Ratios between t50 and tend parameters obtained for glucose and fructose consumption at the total sugar concentration of 90g/L divided by those obtained at different total sugar concentrations

2.3 糖濃度對(duì)細(xì)胞生成和乙醇合成的影響

不同糖濃度下，酵母GJ2008果糖與葡萄糖發(fā)酵過程中細(xì)胞生成和乙醇合成的情況見圖2。由圖2可知，隨著糖濃度的提高，前期酵母細(xì)胞的生成受其影響程度較小，而后期酵母細(xì)胞的生成曲線逐漸拉開，進(jìn)入穩(wěn)定期時(shí)酵母數(shù)維持值明顯不同，表現(xiàn)為總糖250g/L及以上已經(jīng)不利于酵母數(shù)的維持。相比細(xì)胞生成，隨著糖濃度升高，前期乙醇合成曲線幾乎重合，可以說明發(fā)酵速率受糖濃度的影響程度較小。DAMORE T[19]指出發(fā)酵速率較細(xì)胞生成更耐受糖所產(chǎn)生乙醇的沖擊，一定程度上可以解釋此現(xiàn)象。

不同糖濃度下最終發(fā)酵結(jié)果如表4所示。由表4可知，最大細(xì)胞比生長(zhǎng)速率及最大乙醇比合成速率分別在90g/L和230g/L糖濃度條件下獲得，而結(jié)合圖2可知，酵母數(shù)較高維持值和乙醇產(chǎn)率最大值均出現(xiàn)在230g/L。故最適發(fā)酵糖濃度為230g/L，發(fā)酵時(shí)間為24h，乙醇產(chǎn)率為4.31g/L·h。

2.4 糖濃度對(duì)果糖與葡萄糖利用差異性的影響

dGF/dG=[dG-dF]/dG即[單位時(shí)間內(nèi)葡萄糖消耗量（dG）-單位時(shí)間內(nèi)果糖消耗量（dF）]/單位時(shí)間內(nèi)葡萄糖消耗量（dG），dGF/dG值作為衡量果糖與葡萄糖利用差異性的指標(biāo)[15]，不同糖濃度下酵母GJ2008果糖與葡萄糖混合發(fā)酵dGF/dG值見圖3。由圖3可知，對(duì)于總糖90g/L，在dGF/dG值發(fā)酵過程中迅速減少，直至發(fā)酵結(jié)束；對(duì)于總糖230g/L、250g/L和270g/L，該值發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)6h～18h相差不大，但前者發(fā)酵至24h，該值減少程度分別是后兩者的4.85倍和4.20倍，說明較低糖濃度有利于后期果糖和葡萄糖利用差異性的縮小。這可能與氮源的消耗相關(guān)，較低糖濃度利于可同化氮源的消耗[17]，從而糖運(yùn)輸酶得到有效合成，并且促進(jìn)果糖消耗大于葡萄糖消耗，從而縮小了果糖與葡萄糖利用的差異性[15]。

圖2 不同糖濃度下酵母GJ2008果糖與葡萄糖混合發(fā)酵酵母生成和酒精生成曲線Fig.2 Profiles of biomass production and ethanol accumulation during the ethanol fermentation from YPDF media byS.cerevisiae GJ2008 at different total sugar concentrations

表4 不同糖濃度下酵母GJ2008果糖與葡萄糖混合酒精發(fā)酵結(jié)果Table 4 Performances ofS.cerevisiae GJ2008 in YPDF at different total sugar concentrations in the shake flask

圖3 不同糖濃度下酵母GJ2008果糖與葡萄糖混合發(fā)酵dGF/dG值變化曲線Fig.3 Profiles of dGF/dG value during the ethanol fermentation from YPDF media byS.cerevisiae GJ2008 at different total sugar concentrations

3 結(jié)論

酵母GJ2008等濃度果糖和葡萄糖混合發(fā)酵結(jié)果表明：糖濃度對(duì)果糖代謝的影響要大于對(duì)葡萄糖代謝的影響，較低糖濃度有利于后期果糖與葡萄糖利用差異性的縮??；糖濃度250g/L～270g/L，果糖后期利用緩慢的主要原因并非乙醇的抑制作用。

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