張新欣，魏冬婷，柯瓊?cè)A，程 超*

（湖北民族學(xué)院 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 恩施 445000）

茶僅次于水，以它為主體加工的產(chǎn)品在全球市場占據(jù)著不可取代的地位。茶多酚（tea polyphenols，TP）是一種從茶葉中提取的天然復(fù)合物，茶葉中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)約15%～30%[1]。富含多酚類物質(zhì)的茶葉具有明顯的抗氧化、抗菌消炎效果[2-3]。

前人研究發(fā)現(xiàn)膳食因素均會(huì)影響到茶的抗氧化特性，ALEXANDROPOULOU I等[4]發(fā)現(xiàn)在體外模擬胃腸液中，鐵離子、肉類和酪蛋白會(huì)降低綠茶的抗氧化能力，而VC可使綠茶的抗氧化性能增強(qiáng)。SHARMA V等[5]研究了純紅茶、紅茶加糖、紅茶加牛奶、紅茶加牛奶和糖的抗氧化和自由基清除作用，發(fā)現(xiàn)對(duì)自由基清除能力強(qiáng)弱為純紅茶＞紅茶加糖＞紅茶加牛奶和糖＞紅茶加牛奶。RYAN L等[6]發(fā)現(xiàn)全脂牛奶、半脫脂牛奶、脫脂牛奶會(huì)降低茶湯的抗氧化能力，脫脂牛奶對(duì)其抗氧化能力的降低程度顯著強(qiáng)于全脂牛奶和半脫脂牛奶。STASZEWSKI MV等[7]發(fā)現(xiàn)乳清蛋白會(huì)降低綠茶對(duì)1，1-二苯基苦基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除作用和抑菌能力。DUBEAU S等[8]用2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2，2'-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS）、伏安法、脂質(zhì)過氧化的方法評(píng)價(jià)牛奶對(duì)綠茶、大吉茶和英式早餐茶的抗氧化能力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用ABTS方法，牛奶降低3種茶的抗氧化的能力，但不同茶葉降低程度不同；伏安法的降低程度是ABTS方法的4倍，而脂質(zhì)過氧化中，牛奶可提高3種茶抗氧化能力，因此牛奶對(duì)茶的抗氧化能力具有雙重作用。因此本研究主要在前人研究基礎(chǔ)上，考慮到日常飲食中的主要營養(yǎng)素如蛋白質(zhì)（全脂牛奶、脫脂牛奶）、甜味劑（蔗糖、阿斯巴甜）等對(duì)茶多酚抗氧化作用的影響，采用活性氧體系和基于電子轉(zhuǎn)移的兩種體系研究上述膳食因素對(duì)茶多酚抗氧化特性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

綠茶：恩施炒青綠茶。

脫脂牛奶：完達(dá)山脫脂奶粉（蛋白質(zhì)34%，碳水化合物53.2%，脂肪1.30%）。

全脂牛奶：伊利全脂甜奶粉（蛋白質(zhì)19%，碳水化合物52.8%，脂肪23.1%）。

蔗糖；乙酸；乙酸鈉；硫酸亞鐵；三羥甲基氨基甲烷；雙氧水；過硫酸鉀；無水乙醇等試劑均為分析純，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；阿斯巴甜購于上海浦幫食品添加劑有限公司；ABTS購于美國TCI公司；鄰二氮菲購于沈陽市試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

756MC紫外可見分光光度計(jì)：上海精研電子科技有限公司；RE-2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；ALPHA1-2真空冷凍干燥設(shè)備：德國M.CHRIST；GZX-9140 MBE型電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；DL-5低速大容量離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；SHZ-82A數(shù)顯水浴恒溫振蕩器：金壇市科興儀器廠；SG-4050C恒溫水浴鍋：上海蘇豪智能系統(tǒng)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 茶多酚的提取工藝流程[9]

取100g炒青綠茶，粉碎，按料液比1∶10加入70%vol乙醇70℃回流提取1h，4000r/min離心15min后取沉淀二次提取，合并兩次上清液，旋蒸濃縮，真空冷凍干燥，得粗茶多酚粉末，備用。

1.3.2 抗氧化性能的測定

（1）茶多酚對(duì)ABTS自由基的抑制能力[10-11]

將5mL的7mmol/L ABTS和88μmol的140mmol/L過硫酸鉀混合，在室溫避光的條件下靜置12h～16h，形成ABTS自由基貯備液。再將ABTS儲(chǔ)備液用10mmol/L pH值為7.4磷酸緩沖液稀釋，使其在734nm波長條件下的吸光度為0.70±0.02，待用。

配制0.20mg/mL、0.40mg/mL、0.60mg/mL、0.80mg/mL、1.0mg/mL茶多酚溶液，取1mL配置好的ABTS測試液加入3μL樣品溶液振搖30s，反應(yīng)6min后在734nm波長條件下測定其吸光度A樣。重復(fù)3次，取其平均值。ABTS自由基清除率計(jì)算公式：

（2）茶多酚對(duì)羥基自由基的清除作用

利用Fenton體系產(chǎn)生·OH[12-15]：首先配制0.20mg/mL、0.40mg/mL、0.60mg/mL、0.80mg/mL、1.0mg/mL茶多酚溶液。

取1mL 0.75mmol/L鄰二氮菲溶液于試管中，加入2.0mL pH值為7.4的0.20mol/L的磷酸緩沖液，混勻后加0.75mmol/L硫酸亞鐵溶液1.0mL和0.010%的雙氧水1mL，37℃水浴1h后，在波長536nm條件下測定吸光度A536nm，此為損傷管的吸光度（A損傷）。未損傷管（A空白）以1mL蒸餾水代替損傷管中雙氧水，操作方法同損傷管。樣品管（A樣品）以0.20mL樣品溶液代替損傷管中的蒸餾水，操作方法同損傷管。重復(fù)3次取平均值。羥基自由基清除率計(jì)算公式：

（3）樣品溶液的配制

依據(jù)人類攝入蛋白（全脂奶粉、脫脂奶粉）、甜味劑（蔗糖、阿巴斯甜）等的參考量來設(shè)置其質(zhì)量濃度梯度，分別配制蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度梯度為70mg/mL、50mg/mL、30mg/mL、10mg/mL，甜味劑質(zhì)量濃度梯度為10.0%、8.0%、6.0%、4.0%、2.0%。以茶多酚溶液/膳食因素溶液為1∶1的比例進(jìn)行混合，考察混合后茶多酚的抗氧化特性的變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 膳食因素對(duì)茶多酚清除ABTS自由基能力的影響

2.1.1 茶多酚對(duì)ABTS自由基的抑制作用

由圖1可知，在一定的濃度范圍內(nèi)，一定質(zhì)量濃度茶多酚溶液對(duì)ABTS自由基抑制作用隨著含量增加而逐漸增大，二者線性相關(guān)，線性回歸方程為y=61.229x+0.0824，相關(guān)系數(shù)為R2=0.9909。通過回歸方程可計(jì)算出茶多酚對(duì)ABTS的IC50為0.82mg/mL。在與膳食因素混合時(shí)則采用此濃度。

圖1 茶多酚對(duì)ABTS自由基的清除能力Fig.1 The elimination rate of TP on ABTS

2.1.2 膳食因素對(duì)茶多酚清除ABTS作用的影響

圖2、圖3分別表明奶粉和甜味劑與茶多酚混合前、后抗氧化性能的變化。由圖2可知，脫脂奶粉+茶多酚的對(duì)ABTS的抗氧化效果要優(yōu)于全脂奶粉+茶多酚，但二者均會(huì)使茶多酚的抗氧化效果下降，并且具有明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系，最高質(zhì)量濃度的脫脂奶粉可使茶多酚對(duì)ABTS的清除率下降53.00%，全脂奶粉則可使其下降63.05%，其主要原因可能是因?yàn)榕Ｄ讨械牡鞍踪|(zhì)和碳水化合物與茶多酚相互作用導(dǎo)致茶多酚抗氧化效果下降[4]，但是脫脂奶粉的抑制效果弱于全脂奶粉的可能是因?yàn)樵谀谭叟浞街刑砑拥挠蠽A等物質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與RYAN L等[6]的研究結(jié)果不同，可能與室驗(yàn)茶葉種類有關(guān)，實(shí)驗(yàn)材料選用的是紅茶，本實(shí)驗(yàn)為綠茶材料。

由圖3可知，蔗糖和阿斯巴甜均可降低茶多酚的抗氧化效果，低濃度時(shí)二者的影響效果相當(dāng)，但隨著甜味物質(zhì)的質(zhì)量濃度增加，蔗糖對(duì)茶多酚抗氧化的降低程度略大于阿斯巴甜，實(shí)驗(yàn)中高質(zhì)量濃度蔗糖和阿斯巴甜對(duì)茶多酚抗氧化的降低效果分別為58.59%和53.82%。

圖2 奶粉對(duì)茶多酚清除ABTS自由基的影響Fig.2 Effect of milk powder on the elimination effect of TP on ABTS

圖3 甜味劑對(duì)茶多酚清除ABTS自由基的影響Fig.3 Effect of sweeter on the elimination effect of TP on ABTS

2.2 對(duì)羥自由基的清除作用

2.2.1 茶多酚對(duì)羥自由基的清除作用

圖4 鄰二氮菲體系中茶多酚對(duì)·OH的清除作用Fig.4 Elimination effect on·OH of TP in the 1,10-phenanthroline monohydrate system

由圖4可知，在一定的濃度范圍內(nèi)，一定質(zhì)量濃度茶多酚溶液對(duì)羥基自由基清除作用隨著含量增加而逐漸增大，二者線性相關(guān)，線性回歸方程為y=35.946x-1.1695，相關(guān)系數(shù)為R2=0.9912。茶多酚對(duì)·OH的IC50為1.49mg/mL，在與膳食因素混合時(shí)則采用此濃度。

2.2.2 膳食因素對(duì)茶多酚清除羥自由基能力的的影響

圖5、圖6表明奶粉、甜味劑與茶多酚混合前、后的抗氧化性能的變化。

圖5 奶粉對(duì)茶多酚清除·OH的影響Fig.5 Effect of milk powder on the elimination effect of TP on·OH

由圖5可知，全脂奶粉+茶多酚對(duì)·OH的抗氧化效果要優(yōu)于脫脂奶粉+茶多酚，二者均會(huì)使茶多酚的抗氧化效果下降，且具有明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的最高質(zhì)量濃度脫脂奶粉和全脂奶粉使茶多酚對(duì)·OH的抑制效果分別下降36.39%和24.17%。

圖6 甜味物質(zhì)對(duì)茶多酚清除·OH的影響Fig.6 Effect of sweeter on the elimination effect of TP on·OH

由圖6可知，甜味物質(zhì)同樣會(huì)降低茶多酚的抗氧化特性，但蔗糖與阿斯巴甜的效果相當(dāng)，阿斯巴甜的影響略大于蔗糖的，阿斯巴甜10%和蔗糖10%對(duì)茶多酚抗氧化的抑制作用分別下降30.07%和30.77%。

3 結(jié)論

3.1 實(shí)驗(yàn)表明，本實(shí)驗(yàn)所涉及的幾種膳食因素均會(huì)使茶多酚的抗氧化性能下降，對(duì)ABTS自由基而言，影響的強(qiáng)弱順序?yàn)槿谭郏菊崽牵景⑺拱吞穑久撝谭?；?duì)·OH影響強(qiáng)弱的順序?yàn)槊撝谭郏景⑺拱吞穑菊崽牵救谭?。因此針?duì)不同的自由基，膳食因素使茶多酚抗氧化性能的下降程度不同?？赡苁且?yàn)锳BTS自由基和OH自由基本身的穩(wěn)定性不同，因此各種膳食因素對(duì)二者的影響也就不同。

3.2 蔗糖使茶多酚對(duì)ABTS自由基和·OH的抑制作用的下降效果相當(dāng)，這可能是因?yàn)樘妓衔锟梢耘c茶多酚相互作用，從而封閉茶多酚發(fā)揮抗氧化作用的基團(tuán)[4]，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析差異不顯著。阿斯巴甜+茶多酚對(duì)·OH的抑制作用顯著弱于阿斯巴甜+茶多酚對(duì)ABTS清除作用，·OH的反應(yīng)原理是基于活性氧自由基，而ABTS是基于電子轉(zhuǎn)移的，由此可見阿斯巴甜這種二肽甜味劑會(huì)影響到茶多酚的發(fā)揮抗氧化活性的結(jié)構(gòu)基團(tuán)，但此結(jié)論尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。

3.3 在不同抗氧化體系中，全脂奶粉和脫脂奶粉對(duì)茶多酚的抗氧化效果影響差異很大，在ABTS體系中，全脂奶粉的抑制效果強(qiáng)于脫脂奶粉；而·OH正好相反。這可能與奶粉中所含的復(fù)雜的化學(xué)成分有關(guān)，實(shí)驗(yàn)選用的奶粉為超市購買，由于脂肪種類含量不同，導(dǎo)致其中脂溶性成分等也不同；同時(shí)奶粉配方不同致使其中的VC和VA等類物質(zhì)含量也有差異，因此在不同體系中出現(xiàn)了不同的影響效果。奶粉中添加的這些物質(zhì)對(duì)茶多酚抗氧化效果的影響還有待于進(jìn)一步研究。

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