尹 佳

（吉林化工學(xué)院環(huán)境與生物工程學(xué)院，吉林 吉林 132022）

抗菌肽（antimicrobial peptides）是具有抗菌活性的一類肽的總稱。通常由13～50個氨基酸組成，為陽離子型多肽[1]。兩性α-螺旋結(jié)構(gòu)和兩性β-折疊結(jié)構(gòu)是抗菌肽最顯著的結(jié)構(gòu)特征。抗菌肽對細(xì)菌具有很強(qiáng)的殺傷作用，不宜在原核系統(tǒng)中直接表達(dá)，一般采用融合表達(dá)或在酵母中表達(dá)[2-3]。

本研究通過對抗菌肽Magainin-Ⅱ和JaponicinⅡ兩個基因（簡稱M和J）的一級結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu)的分析，用一段編碼ser-ser-gly-ser-gly-ser的柔性連接肽序列將M基因和J基因相連，以利于M和J基因各自的空間折疊。選用巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）偏愛的密碼子，通過重疊區(qū)基因擴(kuò)增法（SOE法）[4]人工合成MgJ基因，然后將其連接至在巴斯德畢赤酵母中高效表達(dá)的表達(dá)載體pPICZα A上。其設(shè)計(jì)目的是獲得比MagaininⅡ和JaponicinⅡ生物活性更高的抗菌肽，為雜合抗菌肽MgJ的高效分泌表達(dá)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α、質(zhì)粒pPICZα A 均由本實(shí)驗(yàn)室保存，內(nèi)切酶、dNTP、T4連接酶、DNA marker、PCR 擴(kuò)增試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒購自TaKaRa寶生物工程有限公司。引物由聯(lián)星生物合成，其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 基因的合成

引物設(shè)計(jì)：根據(jù)GenBank中的基因序列，在M基因和J基因中間用鉸鏈ser-ser-gly-se r-gly-ser連接，按照畢赤酵母偏愛密碼子表[5]設(shè)計(jì)合成8個引物，其中Up1含有EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，Down2含有XbaⅠ酶切位點(diǎn)。各引物序列見表1。

表1 合成MgJ基因的引物序列Table 1 MgJ primers sequencs

各引物與模板之間的互補(bǔ)關(guān)系見圖1。

圖1 各引物與模板之間的互補(bǔ)關(guān)系示意圖Fig.1 Complementation of primers

MgJ基因的合成：M1+M2（J1+J2）：94℃、5min；94℃、30s，60℃、30s，72℃、30s，每一個循環(huán)增加0.2℃，共35個循環(huán)；72℃、10min。經(jīng)電泳檢測后割膠回收DNA片段，并命名為M基因。相同條件下J1和J2合成J基因。

Up1-M-Down1（Up2-J-Down2）：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s、56℃退火30 s、72℃延伸30s；每一個循環(huán)增加0.1℃，共30個循環(huán)；72℃延伸10min。

全長片段：Up1-M-Down1、Up2-J-Down2互為引物，94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s、56℃退 火30s、72℃延伸30s；每一個循環(huán)增加0.1℃，共30個循環(huán)；72℃延伸10min。

以上各PCR體系均為100mL。

1.2.2 目的基因的鑒定目的基因經(jīng)PCR擴(kuò)增后，取5μLPCR產(chǎn)物與DNA marker 2.0%瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.3 表達(dá)載體的構(gòu)建目的基因表達(dá)載體的構(gòu)建策略見圖2。

圖2 重組質(zhì)粒pPICZαA-MgJ構(gòu)建策略Fig.2 Construction of recombinant pPICZα A-MgJ

1.2.4 酶切和連接

目的基因全片段和pPICZα A均用EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切，膠回收后，16℃連接過夜。

1.2.5 感受態(tài)細(xì)胞DH5α的制備和轉(zhuǎn)化

按常規(guī)方法操作[6-8]。

1.2.6 陽性克隆的篩選

Zeocin篩選法[9]。

1.2.7 重組質(zhì)粒的鑒定及DNA序列分析

挑取重組菌培養(yǎng)，提取質(zhì)粒[10]，用EcoRⅠ/XbaⅠ雙酶切初步鑒定重組子。DNA序列分析由上海生工生物工程公司完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 MgJ基因的合成

各引物片斷拼接采用重疊PCR擴(kuò)增出完整的基因。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，大小與預(yù)計(jì)的163bp相符。結(jié)果見圖3、圖4。

圖3 目的基因的2%瓊脂糖凝膠電泳Fig.3 Agarose gel electrophoresis of genes

圖4 MgJ的2%瓊脂糖凝膠電泳Fig.4 Agarose gel electrophoresis ofMgJ

2.2 陽性克隆的篩選結(jié)果

目的基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收后與pPICZα A載體連接轉(zhuǎn)化至EcoDH5α中，由于EcoRⅠ/XbaⅠ雙酶切線性化的pPICZα A不可能自身環(huán)化[11-12]，因此Zeocin 抗性菌落應(yīng)含有所需要的重組質(zhì)粒pPICZα A-MgJ。

2.3 重組質(zhì)粒的鑒定及測序

將獲得的重組質(zhì)粒pPICZα A-MgJ用EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，在相應(yīng)位置出現(xiàn)條帶，表明pPICZα A-MgJ構(gòu)建成功，結(jié)果見圖5。測序表明，基因序列與預(yù)期相符。

圖5 pPICZα A-MgJ雙酶切的瓊脂糖凝膠電泳Fig.5 Agarose gel electrophoresis of pPICZα A-MgJ digestion

3 結(jié)論

抗菌肽必須具備兩親結(jié)構(gòu)和正電荷，較多的正電荷與穩(wěn)定的兩性α-螺旋結(jié)合，有助于提高殺菌活性。因此，可利用這一原則來設(shè)計(jì)新型的雜合抗菌肽[13]。本研究在MagaininⅡ和JaponicinⅡ之間用一段ser-ser-gly-ser-gly-ser的柔性連接肽序列將2個基因相連，以利于增強(qiáng)兩段序列的連接，而且還可防止連接的過程中兩條序列單獨(dú)表達(dá)互補(bǔ)配對形成二聚體。為了獲得抗菌肽MgJ的全長基因片段，本研究采用了重疊區(qū)擴(kuò)增基因拼接法，用互有一段互補(bǔ)序列的8個引物，通過PCR擴(kuò)增得到了具有EcoRⅠ/XbaⅠ雙酶切位點(diǎn)的全長基因。

本研究以pPICZα A作為表達(dá)載體。因?yàn)閜PICZα A即可以在原核細(xì)胞中表達(dá)，也可在真核細(xì)胞中表達(dá)，同時其表達(dá)盒的N端帶有引導(dǎo)分泌的α交配因子（α-MF）信號序列，表達(dá)產(chǎn)物可以分泌到細(xì)胞外的培養(yǎng)基中[14-15]。由于酵母本身分泌到培養(yǎng)基中的蛋白很少，因此表達(dá)上清中的雜質(zhì)蛋白含量很低，為進(jìn)一步純化表達(dá)蛋白提供了極大的方便。

研究結(jié)果表明，成功地構(gòu)建了抗菌肽MgJ基因穿梭表達(dá)載體pPICZα A-MgJ，為雜合抗菌肽MgJ的高效分泌表達(dá)奠定了基礎(chǔ)。

[1]劉立偉，鄧 磊.抗菌肽作用機(jī)制的研究進(jìn)展[J].河北化工，2012，35（7）：13-15.

[2]RAMANATHAN B,DAVIS EG,ROSS CR,et al.Cathelicidins:microbicidal activity,mechanisms of action,and roles in innate immunity[J].Microbes Infect，2002，4（3）：361-372.

[3]胡功鈴，陳國平，胡宗利，等.雜合抗菌肽HMCM 的原核表達(dá)及其活性鑒定[J].藥物生物技術(shù)，2012，19（1）：6-10.

[4]韓晉輝，施用暉，呂文平，等.多重PCR 合成天蠶素基因及其在E.Coli中的克隆[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2006，25（4）：109-112.

[5]趙 翔，霍克克，李育陽.畢赤酵母的密碼子用法分析[J].生物工程學(xué)報(bào)，2000，16（3）：308-31.

[6]明雙喜，劉 艷，王沂蒙，等.抗菌肽PMAP37 基因RT-PCR 擴(kuò)增、序列分析及重組原核表達(dá)載體構(gòu)建[J].中國釀造，2008，26（12）：33-35.

[7]喬紅偉，韓俊友，趙瑞利，等.中國林蛙抗菌肽基因在畢赤酵母中的表達(dá)及其活性檢測[J].中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2008，28（6）：663-666.

[8]李桂平，陳儀本.一種新融合抗菌肽Hex-Mag 基因的克隆、表達(dá)及其抗菌活性的研究[J].微生物學(xué)報(bào)，2007，41（1）：115-120.

[9]趙巖巖，崔敬愛，李 帥，等.抗菌肽Cryptonin 基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建[J].農(nóng)業(yè)機(jī)械.2012，21（7）：145-148.

[10]張素芳，曹瑞兵，賈 赟，等.雜合抗菌肽CecA_mil 的改造及在畢赤酵母中的分泌表達(dá)[J].微生物學(xué)報(bào)，2005，45（2）：215-219.

[11]GHOSALKAR A,SAHAI V,SRIVASTAVA A.Optimization of chemically defined medium for recombinanantPichia pastorisfor biomass production[J].Bioresource Technol，2008，99（16）：7906-7910.

[12]RAJESH T,ANTHONY T,SARANYA S,et al.Functional characterization of a new holin-like antibacterial protein coding genetmp1from goat skin surface metagenome[J].Appl Microbiol Biot，2011，89（4）：1061-1073.

[13]周磊磊.促血管生成素-2 在畢赤酵母中的分泌表達(dá)及功能研究[D].北京：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院碩士論文，2008.

[14]蘇 琦，孫 燕，李 治.抗菌肽對細(xì)菌胞內(nèi)殺傷作用的分子機(jī)制[J].中國生物制品學(xué)雜志，2010，23（3）：325-329.

[15]齊長學(xué).牛乳溶菌酶在畢赤酵母中的分泌表達(dá)及活性分析[D].大慶：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)碩士論文，2010.